Пиши Дома Нужные Работы

Обратная связь

Флуоресцентная спектроскопия

Как мы видели, спектры поглощения позволяют получать различного рода информацию о свойствах макромолекул и их взаимодействии с другими молекулами. Однако в случае некоторых молекул поглощение фотона сопровождается испусканием света с большей длиной волны (т.е. меньшей энергией). Испускание света называется флуоресценцией (или фосфоресценцией, если свечение долгоживущее). Спектры флуоресценции в еще большей степени, чем спектры поглощения, зависят от окружения. Для надежной регистрации параметров флуоресценции требуется меньшее количество вещества.

Путем измерения флуоресценции можно получить сведения о конформации макромолекул, местах связывания, взаимодействиях с растворителем, степени гибкости, межмолекулярных расстояниях, коэффициенте вращательной диффузии макромолекул. К тому же флуоресценцию можно использовать для локализации в живых клетках тех веществ, которые невозможно обнаружить другими методами.

Теория флуоресценции, как и других физических методов, пока еще не всегда позволяет провести однозначную корреляцию между флуоресцентными характеристиками и свойствами непосредственного окружения излучателя. Следовательно, и на этот раз возможность применения метода определяют эмпирические правила, полученные путем исследования модельных соединений.

Энергия света поглощается только в том случае, когда молекула переходит с нижнего на верхний энергетический уровень. Если молекула поглощает энергию большую, чем необходимо для того, чтобы достичь первого возбужденного состояния S1, то избыток энергии может возбудить колебания молекулярного остова, и молекула будет находиться на одном из колебательных уровней. Эта колебательная энергия быстро рассеивается в виде тепла путем соударения с молекулами растворителя, и молекула опускается на самый нижний возбужденный уровень S1. Возбужденная молекула далее возвращается на уровень S0, либо излучая свет (флуоресценция), либо путем безизлучательного перехода. Так как при переходе на самый нижний уровень S1энергия теряется, испускаемый свет имеет меньшую энергию (т.е. большую длину волны), чем поглощенный свет. Однако, возвращаясь на уровень S0, молекула вместо "абсолютного" основного состояния может попасть на один из колебательных уровней S0. Эта колебательная энергия будет также рассеиваться в виде тепла.



Следовательно, если имеется много соответствующих подуровней, испускаемый свет будет иметь различные длины волн: форма спектра флуоресценции определяется набором (густотой) всех переходов с нижнего колебательного уровня первого возбужденного состояния на каждый колебательный уровень основного состояния. То есть спектры абсорбции характеризуют распределение колебательных уровней возбужденного состояния, а форма спектров флуоресценции – распределение подуровней в основном (невозбужденном) состоянии молекулы.

Возбужденная молекула не всегда флуоресцирует. Эффективность флуоресценции описывается квантовым выходом Q, а именно отношением числа излученных к числу поглощенных фотонов. Q определяется несколькими факторами; одни из них связаны со свойствами самой молекулы (внутренние факторы), другие – со свойствами окружения. Внутренние факторы обуславливаются распределением колебательных уровней состоянии Soи S1. Например, если колебательный уровень основного состояния обладает той же самой энергией, что и колебательный уровень низкого порядка S1, может иметь место безизлучательный переход с S1на S0, который сопровождается превращением энергии в тепло. Именно так обычно и происходит с гибкими молекулами, потому что для них характерны очень высокие колебательные уровни So. Это является наиболее общим путем рассеяния энергии возбуждения, поэтому флуонофоры довольно редки и почти всегда являются жесткими ароматическими кольцами или системами колец.

При биологических исследованиях обычно большое значение имеют не внутренние факторы, а факторы окружения. За счет этих факторов происходит безизлучательный перенос или тушение флуоресценции. В биологических объектах тушение обычно является результатом либо столкновения (химреакции или просто столкновения с обменом энергии), либо безизлучательного дальнего переноса энергии, называемого резонансным переносом энергии.

6.6. Изучение белков путем измерения
их собственной флуоресценции

При флуоресцентном анализе макромолекул используются два типа молекул флуоресцирующих хромофоров: собственные и внесенные. Здесь мы рассмотрим собственную флуоресценцию.

Белки содержат только три собственных флуорофора – остатки триптофана, тирозина и фенилаланина. На практике чаще всего пользуются флуоресценцией триптофана, потому что фенилаланин имеет очень низкий Q, а флуоресценция тирозина часто очень слаба из-за тушения. Флуоресценция тирозина почти полностью затушена, если он ионизован или расположен недалеко от аминогруппы, карбоксильной группы или триптофана. Ее можно обнаружить при возбуждении на 280 нм.

Основная цель изучения собственной флуоресценции белков – получение информации об их конформации. Возможность этого обусловлена тем, что флуоресценция триптофана, как и флуоресценция тирозина, существенно зависит от окружения (т.е. растворителя, рН, присутствия тушителя, других молекул или соседних групп в белке).

Эмпирические правила для интерпретации спектров флуоресценции белков

1. Вся флуоресценция белка обусловлена наличием остатков триптофана, тирозина и фенилаланина.

2. При уменьшении полярности растворителя lмахв спектре флуоресценции триптофана смещается в область более коротких волн, а интенсивность при lмахвозрастает.

3. Если вещества, известные как тушители, например иодид, нитрат или ионы цезия, тушат флуоресценцию триптофана или тирозина, то эти аминокислоты должны быть на поверхности белка. Если тушения не происходит, то это возможно по нескольким причинам:

Ÿ аминокислота находится внутри молекулы;

Ÿ аминокислота находится в полости, размеры которой слишком малы, чтобы туда вошел тушитель;

Ÿ аминокислота в сильно заряженном участке, и заряд может отталкивать тушитель (если тушитель заряжен противоположно).

4. Если вещество, которое не влияет на квантовый выход свободной аминокислоты, действует на флуоресценцию белка, то это происходит за счет конформационных перестроек белка.

5. Если триптофан или тирозин находится в полярном окружении, характерные для них величины Q понижаются при возрастании температуры, тогда как в неполярном окружении изменения величин Q незначительны.

6. Q триптофана и тирозина понижается, если a-карбо­ксиль­ная группа этих аминокислот протонирована.

7. Флуоресценция триптофана тушится соседними протонодонорными группами. Следовательно, если рК измеренная путем контроля флуоресценции триптофана, такой же, как рК известной, способной к ионизации группы (например, имидазола гистидина), то эта группа должна находиться очень близко от триптофана.

8. Если при связывании какой-либо молекулы с белком тушится флуоресценция триптофана, то это либо происходит в результате конформационной перестройки белка, либо часть триптофановых участков находится в месте связывания или близко от него.

Конечно, все эти правила не дают абсолютной уверенности в правильности интерпретации, поскольку флуоресценция очень чувствительна к факторам окружения, тем не менее они очень полезны для предварительного получения информации, что должно быть дополнено получением данных другими независимыми методами.

Поляризация флуоресценции

Прежде всего необходимо напомнить, что поглощение поляризованного света хромофором максимально, когда плоскость поляризации света параллельна особой оси хромофора, называемой электрическим дипольным моментом. Обычно хромофоры ориентированы беспорядочно; следовательно, вероятность поглощения возбуждающего света (поляризованного) пропор­цио­нальна соs2q, где q – угол между плоскостью поляризации и электрическим дипольным моментом. Кроме того, плоскость поляризации испускаемого света определяется не дипольным моментом поглощения, а собственным дипольным моментом перехода (который обычно не параллелен) дипольному моменту поглощения, и вероятность испускания флуоресценции с плоскостью поляризации под углом q к дипольному моменту перехода пропорциональна sin2q. Поэтому, если два диполя не параллельны, а поглощающие группы расположены беспорядочно (не стационарно) поляризация Р флуоресценции < 1/2 . Обычно эта величина еще меньше.

Многие другие факторы могут увеличивать степень деполяризации; наиболее важные с точки зрения характеристики биообъектов являются два из них: движение поглощающей группы и перенос энергии между одинаковыми хромофорами. На степень движения группы оказывают влияние температура, вязкость растворителя, а также размер и форма молекулы, содержащей излучающую группу.

Второй фактор – перенос энергии между идентичными хромофорами – обусловлен тем, что, хотя резонансный перенос энергии с наибольшей вероятностью происходит между молекулами, имеющими параллельные диполи, он происходит между молекулами и когда они не параллельны, приводя к деполяризации. Этот тип деполяризации сильно зависит от концентрации, поскольку эффективность переноса энергии уменьшается с шестой степенью расстояния между донором и акцептором. при очень высокой вязкости и высокой концентрации обнаруживается главным образом эффект переноса энергии, а при низкой вязкости и низкой концентрации – эффект молекулярного движения. Эти эффекты могут быть использованы для получения такой информации о макромолекулах, которую нелегко получить другими методами.

Основное правило для интерпретации данных по поляризации флуоресценции и несколько следствий из него.

Правило: при возрастании подвижности поляризация уменьшается.

Следствия:

1. Поляризация фактически не проявляется для несвязанных флуорофоров в растворе (из-за их быстрого вращения).

2. Если флуоресцирующий хромофор связан с макромолекулой, поляризация может стать значительной благодаря сильному уменьшению подвижности. Степень поляризации зависит не только от подвижности молекулы как целого, но и подвижности места связывания.

3. Если макромолекулы агрегируют, то поляризация возрастает.

4. Если макромолекулы претерпевают конформационную перестройку, то поляризация уменьшается, когда молекулярная структура становится более беспорядочной, и увеличивается, когда становится более упорядоченной.

Содержание

1. Коллоидная химия. 3

1.1. Классификация коллоидных систем.. 3

1.2. свойства коллоидных растворов. 4

1.3. Методы приготовления коллоидных растворов. 6

1.4. Оптические свойства и методы исследования коллоидных растворов 6

1.5. рассеяние света (опалесценция) 6

1.6. нефелометрия. 8

1.7. Абсорбция (поглощение) света коллоидами и окраска коллоидных растворов. 9

2. Молекулярно-кинетические свойства коллоидных растворов. 11

2.1. Броуновское движение. 11

2.2. Кинетическая устойчивость дисперсионных систем и седиментационное равновесие. 13

2.3. Осмотическое давление. 15

2.4. Равновесие Гиббса-Доннана. 16

2.5. Электрические свойства коллоидных растворов. Электроосмос и электрофорез. 18

2.6. Строение коллоидных частиц. 19

3. Устойчивость дисперсных систем.. 21

3.1. Основные положения. 21

3.2. Коагуляция гидрофобных коллоидов. 22

3.3. адсорбционно-сольватный барьер как фактор стабилизации коллоидных систем.. 25

3.4. Электрокинетический потенциал. 26

3.5. обратимость коагуляции. Пептизация. 28

3.6. Студни и гели. 28

4. Свойства растворов высокомолекулярных соединений. 30

4.1. Набухание и растворение ВМС.. 30

4.2. Термодинамические свойства растворов ВМС.. 32

4.3. Вязкость растворов ВМС.. 33

4.4. Растворы полимерных электролитов. Изоэлектрическая точка. 35

5. Характеристика некоторых широко применяемых дисперсных систем 36

5.1. Общая характеристика эмульсий. 36

5.2. Устойчивость эмульсий. 36

5.3. Разрушение и обращение эмульсий. 38

5.4. Пены.. 38

5.5. Суспензии. 39

5.6. Аэрозоли. 40

6. Характеристика некоторых спектральных методов исследования растворов ВМС.. 41

6.1. Абсорбционная спектроскопия. 41

6.2. Факторы, влияющие на абсорбционные свойства хромофора. 43

6.3. Инфракрасная спектроскопия. 45

6.4. Спектроскопия комбинационного рассеяния. 47

6.5. Флуоресцентная спектроскопия. 47

6.6. Изучение белков путем измерения их собственной флуоресценции 49

6.7. Поляризация флуоресценции. 51

 


 

Учебное издание

 

 

Авторы:

Киселев Петр Андреевич,

Бокуть Сергей Борисович

 

Курс лекций по коллоидной химии

 

Учебно-методическое пособие

 

 

Редактор М.И. Авхимович

Технический редактор М.Л. Шимкевич

 

Cдано в набор 05.01.2005. Подписано в печать 21.02.2005. Формат 60x84 1/16.

Гарнитура Times New Roman. Усл. печ. л. 3,25. Уч.-изд. л. 2,23. Тираж 50 экз.

 

Международный государственный экологический университет им. А.Д. Сахарова

ул. Долгобродская, 23, 220009, Минск, Республика Беларусь


 






ТОП 5 статей:
Экономическая сущность инвестиций - Экономическая сущность инвестиций – долгосрочные вложения экономических ресурсов сроком более 1 года для получения прибыли путем...
Тема: Федеральный закон от 26.07.2006 N 135-ФЗ - На основании изучения ФЗ № 135, дайте максимально короткое определение следующих понятий с указанием статей и пунктов закона...
Сущность, функции и виды управления в телекоммуникациях - Цели достигаются с помощью различных принципов, функций и методов социально-экономического менеджмента...
Схема построения базисных индексов - Индекс (лат. INDEX – указатель, показатель) - относительная величина, показывающая, во сколько раз уровень изучаемого явления...
Тема 11. Международное космическое право - Правовой режим космического пространства и небесных тел. Принципы деятельности государств по исследованию...



©2015- 2017 pdnr.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.