Пиши Дома Нужные Работы

Обратная связь

Определение количества креатинина в биожидкостях с помощью тест-набора.

Лабораторное занятие №11. Обмен азотистых соединений.

Определение мочевины в биожидкостях.

Мочевина – конечный продукт азотистого обмена у части беспозвоночных, многих позвоночных и большинства млекопитающих. Ее нормальная концентрация в плазме крови зависит от состава и количества пищи, интенсивности распада белков и др. азотистых соединений, обезвреживающей функции печени и азотовыделительной функции почек. Т.о., этот диагностический показатель имеет большое значение для экспериментальных и клинических лабораторий.

Одним из лучших по специфичности, чувствительности и воспроизводимости, является фотометрический метод определения мочевины с диацетилмонооксимом. Он основан на том, что в сильнокислой среде, присутствии ионов трехвалентного железа и тиосемикарбазида, мочевина образует с диацетилмонооксимом комплекс красного цвета, интенсивность окраски которого зависит от ее количества. Внимание!!! Тиосемикарбазид токсичен! При попадании раствора на кожу или в глаза - обильно промыть пораженное место водой. При попадании внутрь - сразу выпить не менее 0,5 л воды и вызвать рвоту. Оказывая первую помощь, пользоваться инструкциями ИОТ-001-05, ИОТ-002-КГУ-06 и немедленно поставить в известность лаборанта и преподавателя!

Ход анализа: 1. С помощью полуавтоматического дозатора, соответственно таблице 1 внести в 3 пробирки следующие растворы:

Таблица 1

 

2. Содержимое пробирок перемешать, прикрыть горлышки колпачками из алюминиевой фольги и, выдержать на кипящей водяной бане точно 10 мин!

3. Тут же, хорошо охладить пробирки под краном и, не позже чем через 15 мин., измерить абсорбцию растворов на ФЭКе, при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр), в кювете толщиной 10 мм.



4. По формуле: Мочевина, ммоль/л = 16,65 х Аопыта/А стандарта, рассчитать ее концентрацию в исследуемой сыворотке.

 

Определение количества мочевой кислоты по методу Мюллера - Зейферта в биожидкостях.

Определение концентрации мочевой кислоты имеет диагностическое значение при заболеваниях почек и подагре. Резкое увеличение ее концентрации связано с нарушением обмена нуклеопротеидов. Норма содержания мочевой кислоты в сыворотке крови – 0,12 – 0,24 ммоль/л.

Принцип метода основан на колометрировании окрашенных продуктов, образующихся при восстановлении фосфорно-вольфрамового реактива мочевой кислоты.

ХОД РАБОТЫ

В две центрифужные пробирки разлить согласно приведенной ниже таблице 2 реактивы.

Таблица 2

Реактивы Количество реактива, мл
Опыт Контроль
Сыворотка 1,5 -
Стандартный рабочий раствор мочевой кислоты, 0,02 г/л - 0,5
Вода 1,5 0,5
ТХУ, 200 г/л 1,5 0,5
Перемешать, оставить на 30 мин
Центрифугировать 5 мин
Центрифугат 1,5 -
Насыщенный раствор соды 0,7 0,7
Реактив Фолина, капель
Через 10 минут колориметрировать на КФК при λ = 540 нм, кювета 5мм против воды

Расчет содержания мочевой кислоты производят по формуле:

Ск * Аоп

Сх = ----------------- * 5,94, где

Ак

Сх – концентрация мочевой кислоты в сыворотке, ммоль/г;

Ск – концентрация мочевой кислоты в стандартной пробе, г/л;

Аоп – оптическая плотность пробы;

Ак – оптическая плотность контрольного образца;

5,94 – коэффициент перерасчета концентрации мочевой кислоты в крови.

Определение количества креатинина в биожидкостях с помощью тест-набора.

Креатинин – ангидрид креатина, содержащийся в крови, мозге и особенно в мышцах, как в форме транспортного макроэрга - креатинфосфата, так и в свободном состоянии. Следы креатина есть в нормальной моче, но в мышцах, он неферментативно и необратимо распадается до креатинина. Эндогенный креатинин экскретируется в почках клубочковой фильтрацией и секрецией в микротрубочках, со скоростью ~ на 20 % больше клиренса инулина.

Его суточная экскреция удивительно пропорциональна массе мускулатуры (табл. 3) и составляет в моче женщин – 53-97 мкмоль/л и 61-115 мкмоль/л у мужчин.

Таблица 3

Возрастные нормы содержания (мг/кг) в суточной моче

(по Murray R.K. et al., 1990)

 

Обмен этих соединений азота связан с аминокислотой глицином и незаменимыми для консументов, аргинином и метионином (рис. 1).

Принцип метода: В щелочной среде креатинин взаимодействует с пикриновой кислотой, давая оранжево-красную окраску (реакция Jaffe), которую измеряют фотометрически. Метод малоспецифичен, т.к. восстановители типа глюкозы, вещества с активной метиленовой группой, кетокислоты, мочевина, мочевая кислота и пигменты: билирубин, Hb – могут завышать результаты. Поэтому определение ведут после осаждения белков биожидкостей.

 

Рис. 1. Схема обмена креатина и креатинина

 

Ход работы: 1. В соответствии с таблицей 4, внести в 3 пронумерованных центрифужных пробирки:

Таблица 4

* - В связи с необходимостью экономии стандартного раствора креатинина, пробу 3 – Стандарт, с концентрацией креатинина 177 мкмоль/л и добавкой СА, на группу студентов, выполняет лишь одна рабочая пара.

2. Растворы перемешать и точно через 20 мин фотометрировать при λ 490 нм, в кювете толщиной 10 мм против контроля, абсорбцию пробы и стандарта.

3. По формуле: Креатинин, мкмоль/л = 177 х А опыта/А стандарта,

рассчитать концентрацию креатинина в исследуемой сыворотке.

Нормальное содержание креатинина в плазме крови здоровых людей: 0,7-1,5 мг/дл или 60-132 мкмоль/л. Оно может повышаться при приеме ряда лекарств и острых и хронических воспалительных болезнях почек.






ТОП 5 статей:
Экономическая сущность инвестиций - Экономическая сущность инвестиций – долгосрочные вложения экономических ресурсов сроком более 1 года для получения прибыли путем...
Тема: Федеральный закон от 26.07.2006 N 135-ФЗ - На основании изучения ФЗ № 135, дайте максимально короткое определение следующих понятий с указанием статей и пунктов закона...
Сущность, функции и виды управления в телекоммуникациях - Цели достигаются с помощью различных принципов, функций и методов социально-экономического менеджмента...
Схема построения базисных индексов - Индекс (лат. INDEX – указатель, показатель) - относительная величина, показывающая, во сколько раз уровень изучаемого явления...
Тема 11. Международное космическое право - Правовой режим космического пространства и небесных тел. Принципы деятельности государств по исследованию...



©2015- 2017 pdnr.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.