Разделение белковых фракций методом электрофореза.

Лабораторное занятее №4. Строение и функции биополимеров. Методы разделения и очистки биомолекул.

Разделение аминокислот методом хроматографии на бумаге.

Известно, что основоположник хроматографии М. С. Цвет (1872 – 1919) разделил экстракт пигментов растений (1903) по их сорбции на колонке каолина = белой глины. Т.к. в потоке элюента = жидкости, фильтрующейся через носитель, скорости движения компонентов разделяемых смесей обратны степени их сорбции, Arne Tiselius (1902 – 1971, Швеция) предложил термин «сорбционный анализ» и, стал делить смеси, в зависимостиот времени прохождения элюента через колонку или тонкий слой сорбента с развитой поверхностью.

Теоретические основы ионообменной, адсорбционной, распределительной и других видов хроматографии рассмотрены в курсах аналитической и физической химии. Но, т.к. при делении биомолекул, часто одновременно реализуется несколько механизмов, то, не вдаваясь в типы носителей, отметим, что геометрия сорбционного слоя и зависящее от него аппаратное оформление неподвижной фазы, дали ряд вариантов хроматографии (рис 1).

Рис. 1. Схема методов хроматографии

При плоскостных методах, 1-10 мкл смеси разделяемых веществ наносят на бумагу или тонкий слой сорбента, закрепленный на стекле или фольге. Носитель помещают во влажную, чаще стеклянную камеру с элюентом - смесью двух частично смешивающихся жидкостей. За десятки минут элюент перемещается по сорбенту под действием капиллярных сил и гравитации. При этом одна из жидкостей фиксируется на сорбенте, образуя неподвижную фазу, а другая – подвижная, проходит по нему с большей скоростью. В соответствии со степенью растворимости в той или иной части элюента, компоненты смеси распределяются по хроматограмме.

Независимо от принципа деления компонентов, колоночная хроматография возможна вручную, но гораздо удобней специальные приборы – хроматографы. Обычно, при помощи насоса на вход их колонок подают, как разделяемую смесь, так и элюент. А на выходе – размещают детектор, который, независимо от конструкции, в автоматическом режиме непрерывно отражает на диаграмме регистрации = хроматограмме, время выхода и концентрации компонентов в элюате. Варианты колоночной хроматографии (рис. 1) отличаются друг от друга не так диаметром, длиной колонки и типом носителя, как очередностью подачи в нее элюента и разделяемой смеси. Преимущество проявительной хроматографии состоит в том, что колонка не требует регенерации, а зоны компонентов анализируемой смеси – разделяются слоями элюата.

Из таблицы 1 видно, что в соответствии с агрегатным состоянием подвижной фазы, различают газо-жидкостную = ГЖХ и жидкостную хроматографию. Последняя – наиболее разнообразна, т.к. включает в себя фильтрацию в гелях, аффинную и высокоэффективную жидкостную хроматографию = ВЭЖХ, больше известную как HPLC = High pressure liquid chromatography, то есть хроматография под давлением. Т.о., все разнообразие методов хроматографии, как совокупности научных и производственных технологий в разных областях химии, медицины, экологии и т.д., основано на различиях в скоростях движения концентрационных зон компонентов изучаемых смесей, смещающихся относительно сорбента в потоке подвижной фазы.

Таблица 1

Фазовые отношения в хроматографии

Дополнительная литература

1. Справочник по физико-химическим методам исследования

объектов окружающей среды. Под ред. Г. И. Арановича и др. – Л.: Судостроение, 1979. – 648 с.

2. Лабораторное руководство по хроматографическим и смеж-ным методам в 2-х тт. / Под ред. В. Г. Берёзкина. – М.: Мир, 1982.

3. Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. – М.: Наука, 1985. – 534 с.

4. Аффинная хроматография. Методы. – М.: Мир, 1988. – 278 с.

5. Зеленин К. Н. и др. Нобелевские премии по химии за 100 лет. – СПб.: Гуманистика, 2003. – 218 с.

6. http://www.krugosvet.ru/articles/114/1011465/print.htm

Экспериментальная часть

Принципы метода: Смесь двух частично смешивающихся жидкостей, одна из которых – вода, а другая – водонасыщенный органический растворитель, например фенол или н-бутанол, движутся по капиллярам бумаги с разными скоростями, т.к. полярная вода, связываясь с полярной же целлюлозой носителя, создает неподвижную фазу. Напротив, менее полярный органический растворитель движется по бумаге быстрей и служит подвижной фазой.

От обычной фильтровальной, хроматографическую бумагу отличает лишь большая (до 22 %) способность к связыванию воды.

В зависимости от направления движения смеси по носителю, различают одномерную радиальную, восходящую, нисходящую и двумерную хроматографию.

Соответственно структуре своих радикалов, α-аминокислоты и низкомолекулярные пептидылучше растворяются в той или иной фазе элюента и, как вариант распределительной хроматографии, тоже движутся по носителю с разными скоростями.

Экспериментально найдено, что деление аминокислот и пептидов идет эффективней в трехкомпонентных системах растворителей, так как добавки кислот, оснований, спиртов и др., с одной стороны, повышают гидрофильность подвижной фазы, а с другой – изменяют диссоциацию кислых и основных групп компонентов разделяемой смеси.

Выявление = индикацию всех компонентов смеси ведут, опрыскав высушенную хроматограмму из пульверизатора, раствором нингидрина, флуорескамина или о-фталевого диальдегида. Два последних индикатора, в присутствии восстановителей образуют с первичными аминами флуоресцирующие продукты, повышая чувствительность метода до 10^-9 – 10^-11 моля.

Выявленные пятна идентифицируютсравнением со «свидетелями» = чистыми образцами изучаемых веществ и, с помощью расчета коэффициентов подвижности: Rf = a/b, где а и b, соответственно, расстояния в миллиметрах, пройденные веществом и фронтом растворителя. Для данной системы растворителей, величина Rf каждого компонента – const.

Ход работы:

Избегая вероятного проявления отпечатков собственных пальцев, кожа которых секретирует много свободных аминокислот, взять за ребра бумажный диск или квадрат хроматографической бумаги, стороны которого немного больше диаметра чашки Петри и, поместить его на чистый лист своей лабораторной тетради.

С помощью линейки и тонко отточенного простого карандаша, без нажима, разделить диск на 4 – 6 примерно равных секторов.

Исходя из толщины круглых карандашей – 8 мм, его острием сделать в центре диска отверстие диаметром 6-8 мм.

Отступив от края отверстия на 5-10 мм, в каждом секторе поставить заметные точки старта, учитывая, что графит, препятствует растеканию водных растворов! Сбоку обозначить точки цифрами 1, 2, 3 и т.д., а на краю или в углу листа, указать № или инициалы владельца хроматограммы.

Положить диск на керамическую поверхность стола и, заполняя соответствующие графы таблицы протокола, нанести капиллярами на точки старта по капле 0,4 % растворов смеси аминокислот и «свидетелей» – аланина, лейцина, лизина, глутаминовой кислоты и дипептида.

Пока влажные пятна хроматограммы высыхают на воздухе, свернуть из полоски фильтровальной бумаги шириной 10-15 мм «ножку» или «фитиль» и вставить его в отверстие диска.

Открыть чашку Петри с ~10 мл смеси растворителей н-бутанол : уксусная кислота : вода в соотношении 4:1:5 и положить на ее края высушенный диск, проследив, чтоб ножка погрузилась в смесь растворителей.

Прикрыть систему крышкой чашки Петри, засечь время начала хроматографии и периодически контролировать движение фронта растворителя по бумаге.

Дождавшись подхода растворителя к краям бумаги, снять крышку чашки Петри и, пинцетом уложить на нее влажный диск, отметив в протоколе температуру помещения и время хроматографии.

Удалив ножку, высушить хроматограмму в сушильном шкафу при 90-100 С, в течение 10 мин.

Опрыскать хроматограмму 0,2 % раствором нингидрина в 96 % этаноле и повторно высушить ее в течение 5 мин.

Измерить в мм расстояние, пройденное фронтом растворителя от точки старта и занести его в таблицу протокола занятия.

Промаркировав карандашом середину каждого пятна хроматограммы, измерить расстояния их пробега от точек старта, занося результаты в таблицу протокола.

Рассчитать для каждого из пятен величину коэффициента распределения = Rf и занести результаты в таблицу протокола занятия.

Подтвердить результаты идентификации пятен смеси аминокислот, сравнив их положения со «свидетелями».

По мере возможности сделать выводы о влиянии температуры среды на скорость хроматографии и, взаимосвязи структуры аминокислот с их подвижностью в данной системе растворителей.

Разделение белковых фракций методом электрофореза.

Из курса физической химии известен класс пограничных электрокинетических явлений, свойственных дисперсным системам и капиллярам (рис. 2). М. Smoluchowski (1872 – 1917, Польша) объяснил их (1903) возникновением дзета-потенциала, то есть избытка зарядов двойного электрического слоя на границе раздела адсорбционно связанной = неподвижной и тангенциально смещающейся подвижной = диффузионной фазы. Тот же дзета-потенциал, служит и мерой их интенсивности.

Рис. 2 Схема группировки пограничных процессов

Очевидно, что электрокинетические явления не только широко распространены в биосфере, но их принципы часто применяют в различных областях техники и медицины. Из них, в аналитической и диагностической биохимии чаще всего используют методы центрифугирования и электрофореза, за разработку которых, соответственно, Т. Svedberg (1926) и A.W.K. Tiselius (1948) из университета в Упсале (Швеция), удостоены Нобелевских премий по химии.

Попытки деления смесей частиц с помощью электрофореза предпринимали с начала ХХ в. В основу их направленной, катодной или анодной подвижности, легли соответственно, отрицательный или положительный знак и целочисленные величины зарядов. К середине века, аппарат Тизелиуса стал основой электрофореза смесей белков. Он состоял из блока питания постоянного тока, стеклянной камеры с электродами, заполненной буферным раствором и довольно сложной оптики для визуальных наблюдений за делением фракций. Таким образом, вторым фактором деления смесей при свободном электрофорезе в растворе, стали величины рН и ионной силы буфера, изменяющие степень ионизации белков. Так, выбор стандартного рН 8,6 буферного раствора для белков сыворотки крови вызван тем, что в этом случае, все их фракции имеют катодную подвижность. К сожалению, приборы этой конструкции, имели ряд неустранимых недостатков, начиная с хрупкости и низкой разрешающей способности и, кончая высокой стоимостью.

В 1950 г. Durrum et al. предложили вести электрофорез белков сыворотки крови на полосках фильтровальной бумаги, пропитанных буфером. Этот тип электрофореза назвали зональным или зонным, т.к. поддержка среды-носителя ограничила диффузию компонентов смеси. Таким образом, свойства зоны, в качестве которой применяют хроматографическую бумагу, ацетилцеллюлозу, водные гели крахмала, агарозы и полиакриламида = ПАГ, стали третьим фактором деления смесей линейных биополимеров. Наконец, замена: стекла на пластиковые камеры разных конструкций и оптических систем прямого наблюдения на сравнительно простые вспомогательные приемы, резко удешевили конструкцию приборов, стандартизовав основные процедуры метода. (рис. 3).

Рис. 3. Результаты зонного электрофореза нормальной сыворотки крови человека. (По http://immunologia.narod.ru/pic20.1.htm).

На электрофореграмме (внизу) и ден-ситограмме (вверху) видны 5 основных полос и пиков, соответствующих сывороточному альбумину = СА и фракциям глобулинов.

Таким образом, любой современный прибор для зонного электрофореза, как минимум включает в себя блок питания постоянного тока, обычно до 500 В и электрофоретическую камеру принципиально разных конструкций, зависящих от свойств зоны и выбора горизонтального, вертикального или других вариантов метода. До сих пор справедливо утверждение, что электрофорез – в основном аналитический метод. Тем не менее, его тонкие модификации, подобные электрофорезу в гелях, изотахофорезу и изоэлектрофокусированию, удается применить и к целям получения препаратов (Скоупс, 1985). Однако автор предупреждал, что пока не освоены простейшие методики зонного электрофореза, начинающим исследователям не стоит и помышлять об этих изощренных процедурах, связанных с множеством трудностей.

Дополнительная литература

1. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. – М.: Наука, 1981. – 286 с.

2. Остерман Л. А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. – М.: Наука, 1983. – 304 с.

3. Скоупс Р. Методы очистки белков. – М.: «Мир». 1985. – 358 с.

4. Троицкий Г. В. Дефектные белки. Постсинтетическая модификация. – Киев.: Наукова думка, 1991. – 232 с.

5. Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение. – М.: Мир, 1986. – 398 с.

6. http://www.cultinfo.ru/fulltext/1/001/008/126/016.htm

Принципы метода: 1. Подача напряжения на электроды камеры, в которой горизонтально размещены полоски хроматографической бумаги или ацетилцеллюлозы, пропитанные буферным раствором рН 8,6, приводит в состояние направленного движения, как ионы буфера, так и молекулы нанесенной на полоски смеси белков, заряд которых отчасти первичен = собственный, а частично наведен действием буфера.

2. Процесс зонного электрофореза характеризуют двумя величинами: 1) градиентом потенциала – В/см расстояния между электродами и 2) плотностью тока – мА/см поперечного сечения проводников. Понятно, что для стандартизации условий в камере, эти величины должны быть const. Напротив, при сравнении результатов полученных в разных камерах, оба электрических параметра нужно приводить к одинаковым величинам.

3. В зависимости от величин градиента потенциала различают низко- (5-15), средне- (20-40) и высоковольтный (>50) электрофорез. В повседневной практике большинства диагностических лабораторий применяют первый из них. Поэтому правила работы с прибором для электрофореза аналогичны обращению с бытовыми электроприборами. Однако, нужно учитывать, что рост напряжения, автоматически ведет к нагреву системы и чреват ростом диффузии и возможностью денатурации белков! Поэтому, прежде чем повышать градиент потенциала, нужно позаботиться об эффективном охлаждении содержимого камеры.

4. Расчет плотности тока проверяют с помощью миллиамперметра, т.к. при постоянных напряжении и суммарном сечении зоны, он, по закону Ома, устанавливается автоматически.

5. Ацетилцеллюлозную пленку в качестве носителя = зоны, предложил Kohn (1958). При этом сохранилась разрешающая способность метода, а главным преимуществом, по сравнению с хроматографической бумагой, стала большая гидрофобность ацетилированной целлюлозы. Она существенно снизила сорбцию белков зоной, что позволило сократить расход сыворотки на полосу с 20-100 мкл до 1-3 мкл, уменьшить время анализа с 18 ч до 60-90 мин и, наконец, избавиться от «хвостов», снизив размывание фракций. Однако большая гидрофобность ацетилцеллюлозы резко замедляет фильтрацию в ней буфера и существенно ухудшает механическую прочность носителя.

6. Положение белковых фракций в зоне определяют после электрофореза, путем их фиксации и последующей окраски, обычно раствором бромфенолового синего, амидошварца, кумасси синего и др.

7. Так как белки сорбируют разные количества красителя, то их содержание во фракциях можно оценить лишь ориентировочно. Для этого пятна вырезают из зоны, размещают в отдельные пробирки, экстрагируют из них краситель разбавленным раствором едкого натра, после чего проводят фотометрию экстрактов. Гораздо удобней в тех же целях применять денситометр, в котором зоны сканируют через оптопару в постоянном режиме.

Ход работы: 1. Положить на чистый лист лабораторной тетради ацетилцеллюлозную плёнку, матовой поверхностью вверх.

2. Простым карандашом, нанести с одного из концов свой номер, тип образца и, отступив от края 5 см – линию старта, с учетом того что графит, препятствует растеканию водных растворов!

3. Открыть крышку камеры прибора для горизонтального электрофореза ПЭФА-1 и убедиться, что уровень буфера в электродных сосудах одинаков. В противном случае, долить свежий буфер до примерно одного уровня.

4. Пропитать ленку буферным раствором, уложить ее середину на решетку камеры, проследив, чтобы линия старта для белковых фракций плазмы (сыворотки) или раствора Hb, находилась со стороны анода, а для белков теней эритроцитов – с катода.

5. Поочередно и аккуратно опустить концы пленки в электродные сосуды, следя чтобы: 1) ее середина, по возможности не провисала; 2) длинная ось пленки шла в пределах пластиковых границ решетки; 3) края соседних плёнок не соприкасались друг с другом; 4) оба конца пленки погрузились в буферный раствор.

6. Убедившись, что все 8 дорожек камеры заняты пленками и, ожидая, пока последние пропитаются буферным раствором, получить у лаборанта свои образцы белковых фракций крови, выделенных на занятии 6.

7. Убедившись, что все 8 зон пропитаны буферным раствором, ребром покровного стекла или наконечником дозатора, нанести на линии старта образцы белковых фракций.

8. Плотно закрыть камеру крышкой, во избежание испарения буферного раствора. Внимание! Операции 9-20 требуютсоблюдения правил электробезопасности.

9. Убедиться в исправности токонесущих проводов и, вставив их разъем в узел камеры, соединить ее с блоком питания.

10. Убедившись в исправности заземления блока питания и его кабеля, вставить вилку в сетевую розетку. В случае обнаружения каких-либо неисправностей, немедленно доложить о них преподавателю или лаборанту.

11. Клавишей на передней панели блока питания включить прибор в сеть и убедиться, что высвечен индикатор напряжения.

12. Рукояткой потенциометра установить напряжение около 150 В и, переведя среднюю рукоятку передней панели вправо, убедиться, что на 1 см сечения плёнки приходится ток в 1 мА.

13. Вернуть рукоятку в прежнее положение и оставить систему для электрофореза на 60-90 мин, периодически отслеживая ее состояние.

14. За 5-10 мин до окончания электрофореза убедиться, что сушильный шкаф включен и температура в нем близка к 100 С.

15. По истечении срока электрофореза, один из дежурных студентов приносит к прибору горячую решетку сушильного шкафа, а другой тем временем, клавишей на передней панели блока питания выключает прибор и вынимает сетевую вилку из розетки.

16. Отсоединить камеру от токонесущих проводов блока питания и снять с нее крышку.

17. С помощью двух стеклянных палочек, поочередно извлечь из камеры ацетилцеллюлозные плёнки, аккуратно укладывая их на специальный дырчатый планшет.

18. Подсушить пленки на воздухе под тягой, затем перенести их в сушильный шкаф и фиксировать белки при 105 С, примерно 10-15 мин.

19. Один из дежурных студентов, взяв в вытяжном шкафу пластиковую кювету для окраски пленок, подносит ее к сушильному шкафу.

20. Другой дежурный, тем временем, вынимает из сушильного шкафа высохшие пленки и укладывает их в кювету, после чего выключает шкаф.

21. Вернуть кювету с пленками в вытяжной шкаф для органики.

22. Поочередно придерживая пленки стеклянной палочкой, аккуратно залить их из склянки раствором красителя для электрофореза (амидочерный 10 Б). Остающиеся под пленками пузырьки воздуха, по возможности удалить с помощью стеклянных палочек.

23. Через 5-10 минут, слить из кюветы избыток красителя через воронку, в склянку для его хранения и повторного использования.

24. Залить плёнки в кювете отмывающим раствором (3 % уксусная кислота), покачивая ее 5-10 мин, по возможности отмыть пленки от избытка красителя и, слить раствор из кюветы в приемник для отходов.

25. Повторить процедуру 2-3 раза, пока смыв станет почти бесцветным.

26. Высушить плёнки на воздухе или под вентилятором.

27. В соответствии с рис. 10.2, самое интенсивное пятно с наибольшей катодной подвижностью, идентифицировать как фракцию сывороточного альбумина = СА.

28. Приняв электрофоретическую подвижность СА за 1, по аналогии с величинами Rf (занятие 8), рассчитать подвижности остальных фракций белков плазмы.

29. В соответствии с подвижностью идентифицировать белковые фракции и, промаркировав их буквами греческого алфавита в порядке убывания зарядов, занести результаты в протокол занятия.

30. Сравнить картину результатов электрофореза с нефелометрической оценкой высаливания фракций белков плазмы.