Лабораторное занятие №9. Обмен углеводов.

Очевидно, что выявление и количественное определение глицидов может быть важным в экологических и отраслевых изысканиях, связанных с лесоводством, сельским хозяйством и пищевой промышленностью, а самая популярная даже в быту – качественная реакция на запасные гликаны с йодом. К сожалению, механизм ее развития до конца не понят, но с большой долей вероятности его объясняют сорбцией атомов иода между остатками моноз. Из качественных реакций на монозы и дисахара, вспомним про образование окрашенных продуктов конденсации – фурфурола и озазонов, а также реакции серебряного и медного «зеркала», Троммера, с фелинговой жидкостью, реактивом Бенедикта и т.п.

Для нужд физиологии, ветеринарии и медицины исключительно важно количественное определение глюкозы, как основной монозы плазмы животных и интегрального показателя углеводного гомеостаза. В норме, независимо от пола, её концентрация у взрослых людей составляет 4,16 – 5,27 ммоль/л. Но, в зависимости от метода исследований, на результат могут влиять: 1) способ удаления из крови, мешающих определению белков и клеток и 2) степень специфичности и чувствительности качественной реакции, примененной в фотометрии. Поэтому в лабораторной практике, с учетом способа определения, нормальными считаются вариации уровня глюкозы от 2,50 до 6,38 ммоль/л. Так, ряд лабораторий до сих пор применяет в этих целях относительно простой и надежный ортотолуидиновый способ, сохраняющий обычные недостатки колориметрических методик. Но альтернативой ему, все чаще служат высокоспецифичные энзиматические методы, с разной степенью их автоматизации и экспрессности.

1. Определение глюкозы в крови унифицированным ортотолуидиновым методом.

Принцип ортотолуидинового метода определения глюкозы в крови состоит в том, что глюкоза при нагревании с ортотолуидиновым реактивом в растворе уксусной кислоты дает зеленое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации сахара в крови.

ХОД РАБОТЫ

В две пробирки, одну опытную, другую контрольную разлить необходимы реагенты согласно приведенной ниже таблице 1.

Таблица 1

Потом содержимое пробирок колориметрировать на КФК при длине волны λ = 595 в кювете толщиной 5мм против смеси 4,5 мл ортотолуидинового реактива и 0,5 мл ТХУ.

Рассчитать концентрацию глюкозы в пробе по формуле:

Соп = Аоп * (Ск/Ак), где

Соп – концентрация глюкозы в опытной пробе, моль/л;

Ск – концентрация глюкозе в контроле, близкая к определяемой (5,55 – 16,67 ммоль/л);

Аоп – оптическая плотность опытной пробы;

Ак – оптическая плотность контрольного раствора.

2. Количественное определение глюкозы в биологических жидкостях ферментативным методом.

1) Глюкозооксидазный метод определения глюкозы в биожидкостях с помощью тест-наборов фирмы Lachema (Чехия)

Он возможен без осаждения белков плазмы, но при определении глюкозы в цельной крови, плазме и сыворотке с признаками гемолиза, липемии и желтухе, субстраты предварительно депротеинизируют. Поэтому целесообразно привести более полный вариант анализа.

Принцип метода: Белки проб осаждают депротеинизирующим раствором, содержащим уранилацетат, токсичный, как все соли тяжелых металлов! ВНИМАНИЕ!!!При попадании раствора внутрь, немедленно выпить 0,5 л воды и вызвать рвоту, а затем действовать согласно инструкции по ОТ и БЖ.

В соответствии со схемой (рис. 1), ФАД-зависимый Е микробного происхождения глюкозооксидаза в роли биосенсора, специфично окисляет глюкозу в безбелковом надосадке, а затем регенерирует ФАДН2 с помощью кислорода атмосферы. Т.к. сходство структуры и свойств глюкозы и глюконовой кислоты затрудняют их различение, обычно определяют эквимолярную концентрацию пероксида водорода. В данном методе это делают с помощью сопряженной пероксидазной реакции азосочетания, после чего, против воды и стандарта = эталонного раствора глюкозы, фотометрируют интенсивность окраски продукта.

Рис. 1. Схема ферментного анализа количества глюкозы

Ход работы: 1. В маркированную центрифужную пробирку внести 0,5 мл раствора 2 (смесь 0,02 М уранилацетата в 0,82 М хлориде натрия).

2. С помощью полуавтоматического дозатора добавить в пробирку 50 мкл цельной крови с антикоагулянтом, перемешать и оставить в штативе на 10 мин.

3. Попарно уравновесить пробирки на центрифужных весах и разместить их в гнездах по диаметру ротора центрифуги.

4. Убедившись, что все студенты выполнили пп. 1-3, дежурный закрывает центрифугу крышкой и, включает ее при 1500 об/мин на 15 мин.

5. Во время центрифугирования, в 2 пробирки внести по 0,5 мл раствора уранилацетата и, меняя наконечники, добавить дозатором в контроль – 50 мкл дистиллята, а в эталон – 50 мкл раствора 1 (стандарт глюкозы с концентрацией 10 ммоль/л).

6. После центрифугирования, из пробирок, меняя наконечник дозатора, соответственно таблице в 3 маркированных пробирки вносят:

7. Пробы перемешать и поместить в термостат при 37 С на 30 мин.

8. За 10 мин до окончания инкубации, включить для прогрева ФЭК КФК-2,

9. Фотометрировать пробы 2 и 3 против контроля, при λ = 480 нм в кюветах толщиной 5 мм. Результаты измерений абсорбции = А занести в протокол опыта.

10. В соответствии с формулой: Глюкоза, ммоль/л = 10 х А2/А3, где: А2 – абсорбция пробы и А3 – эталона, рассчитать ее концентрацию в крови и сделать выводы из работы.

3. Определение глюкозы в крови с помощью автономного экспресс-анализатора крови.

1) Определение глюкозы в крови с помощью автономного экспресс-измерителя OneTouch Ultra (США)

Принцип метода: Миниатюрный глюкометр работает от внутреннего источника = батарейки напряжением 3 В, управляется с помощью одной кнопки, но зависит от одноразовых электрохимических полосок ПКГЭ-02, изготовленных на основе «сухой химии». Это позволяет применять его в полевых условиях, при чрезвычайных ситуациях, скрининге и оперативном контроле индивидуального пользования. Но, показания прибора должно рассматривать лишь как ориентировочные, требующие подтверждения лабораторным методом и не дают оснований изменять дозировку лекарств без ведома врача. Поэтому можно лишь предполагать, что биосенсор полосок – все та же глюкозооксидаза, иммобилизованная в геле, степень сшитости которого исключает влияние белков и форменных элементов крови. Судя по скорости анализа, химический сигнал преобразуется в электрическую форму, тоже по принципу кислородного электрода Кларка.

Технические характеристики:

1. Диапазон показаний прибора от 1,1 до 33,3 ммоль/л глюкозы.

2. Режим хранения и пользования прибором только в комплекте с одноразовыми полосками OneTouch Ultra, все подробно изложено в прилагаемых к устройству Инструкции и Руководству по эксплуатации.

Противопоказания к применению:

1. Полоски с просроченным сроком годности или несовпадением их кода с кодом, хранящимся в памяти прибора.

Ход работы: 1. Достать из футляра прибор и полоски, разместив их на ровной поверхности.

2. Убедиться, что срок годности полосок не истек.

3. Извлечь тест-полоску из флакона и закрыть его.

4. Ввести тест-полоску контактными полосами и лицевой поверхностью вверх в зону ввода тест-полосок прибора до упора.

5. Прибор включится автоматически. На экране появиться код полоски который должен совпасть с кодом на флаконе.

6. В случае несовпадения кодов полоски и высветившегося на табло – действовать соответственно инструкции к устройству.

7. При появлении на табло прибора мигающего рисунка капли прибор готов для проведения анализа.

8. Обработать подушечку 4-го пальца кисти спиртосодержащим тампоном и, подсушив ее, проколоть кожу одноразовым стерильным скарификатором, соблюдая все правила ТБ.

9. Выдавив каплю крови на пальце, аккуратно поднесите каплю крови к зоне теста на тест-полоске, не прижимайте сильно палец к тест-полоске, и держите в зоне пока контрольное поле не заполнится полностью, пока прибор не начнет обратный отчет времени.

10. Если контрольное поле не успеет заполниться до начала обратного отсчета, не наносите еще каплю крови, лучше используйте другую тест-полоску, т.к. прибор скорей всего выдаст ошибку «Er5»

11. Через 5 секунд на табло высветится измеренная концентрация глюкозы, которую заносят в протокол опыта. После этого извлеките тест-полоску из прибора, прибор автоматически выключится.

12. Убрать за собой рабочее место.

Контрольные вопросы

1. Определите понятие «глициды».

2. Сравните достоинства и недостатки терминов «сахара», «углеводы» и «глициды».

3. Оцените роль глицидов в развитии цивилизации.

4. Дайте рациональную классификацию глицидов.

5. Определите подкласс моноз и их производных. Опишите их свойства, номенклатуру и способ упрощенной записи.

6. Чем объяснить особую роль глюкозы в биосфере?

7. Что Вы знаете об энергетической и пластической роли глюкозы в жизнедеятельности клеток?

8. Что Вам известно о принципах полимеризации моноз?

9. Что Вы знаете о структуре, свойствах и функциях дисахаров и других олигоз?

10. Исходя из значительно меньшей растворимости сахарозы, чем у ее мономеров, предложите технологию ферментного производства конфет с жидкой начинкой.

11. Объясните термин «гликоконъюгаты» и опишите их роль в биосфере.

12. Что Вы знаете о структуре, свойствах и классификации гликанов?

13. Опишите структуру, свойства и локализацию резервных гликанов.

14. Что Вам известно о строении и свойствах «арматурных» и вспомогательных гликанов?

15. Известно, что скорость роста стеблей бамбука может достигать 30 см/сутки. Так как они почти целиком состоят из волокон целлюлозы, ориентированных в направлении роста, а длина остатка глюкозы – 0,45 нм, рассчитайте, на сколько остатков Glc удлиняется молекула целлюлозы за 1 с.

16. Опишите сходство и различия понятий «гликопротеины» и «протеогликаны».

17. Что Вы знаете о структуре и свойствах гликозаминогликанов межклеточного вещества животных?

18. Что Вам известно о строении, свойствах и функциях гиалуроновой кислоты?

19. Что Вы знаете о качественных реакциях на глициды?

20. Объясните смысл определения глюкозы в биожидкостях.

21. Что вы знаете о нормах содержания глюкозы в крови?

22. Что Вам известно о принципах, лежащих в основе количественного определения глюкозы?

23. В чем Вы видите преимущества ферментных методов количественного анализа глюкозы?

24. Оцените производительность изученных методов количественного анализа глюкозы.