РСК с целью раздельного определения IgM и IgG

Список практических навыков по иммунологии

Ориентировочная реакция агглютинации

Ориентировочную реакцию агглютинации ставят на пред­метном стекле.Наносят пастеровской пи­петкой каплю физиологического раствора, затем в ней тщательно размешивают небольшое количество куль­туры до получения гомогенной взвеси бактерий. Рядом с первой каплей наносят каплю сыворотки в разведении 1 : 10, 1 : 20, и смешивают обе капли.Через несколько минут в случае положительного результата наблюдается образование агглютината , которое еще ускорится, если слегка пока­чивать стекло.

2. Реакция развернутой агглютинации с целью серотипирования E. сoli применяется для подтверждения результатов ориентировочной реакции агглютинации с моновалентными сыворотками.

Сначала готовят основное разведение взвеси микроорганизмов (1:50), из которого делают серию разведений путем последовательного переноса 0,5 мл из предыдущей пробирки в следующую пробирку ряда (0,5 + 0,5 физраствора). Из последней пробирки 0,5 мл разведенной взвеси удаляют для сохранения одинакового объема. В контрольную пробирку (контроль антигена) вносят 1 мл изотонического раствора хлорида натрия.

В каждую пробирку с разведениями и в контрольную пробирку вносят пастеровской пипеткой по 2 капли моновалентной сыворотки. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 ч, затем сутки выдерживают при комнатной температуре. Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками: "++++" — полная агглютинация (хлопья агтлютината в абсолютной прозрачной жидкости), "+++" — неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости), "++" — частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная), "+" — слабая , сомнительная агглютинация (жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы), "—" — отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная).

Титрованне агглютинирующей сыворотки

Тип реакции: реакция агглютинации.

Исследуемый материал: сыворотка животного, гипериммунизированного бактериальной взвесью.

Диагоностический препарат: взвесь убитых бактерий, применявшихся для гипериммунизации.

Принцип метода: к серийным разведениям агглютинирующей сыворотки добавляют равные количества взвеси убитых бактерий, применявшихся для получения этой сыворотки.

Положительный результат реакции: образование хлопьев, просветление жидкости. Отрицательный результат: равномерная муть. Применение: для определения титра агглютинирующей сыворотки.

Титр агглютинирующей сыворотки -наибольшее разведение сыворотки, в которой еще наблюдается агглютинация. В данном случае титр агглютинирующей сыворотки равен ...

Реакция агглютинации по Видалю с целью серодиагностики брюшного тифа

Для постановки реакции берут:

1) сыворотку исследуемого больного для определения в ней
антител;

2) О - и Н-диагноста кумы бактерий брюшного тифа, паратифа А и паратифа В;

3) физиологический раствор.

Кровь для получения сыворотки берут в количестве—15—20 капель путем укола мякоти пальца или 2 —3 мл при помощи венепункции.

Дают крови свернуться в термостате в течение 30—60 минут, затем простерилизованной петлей обводят сгусток, отделяя его от стенки пробирки, и дают отстояться сыворотке на холоду до образования над сгустком прозрачного слоя. Сыворотку помещают пипеткой в отдельную пробирку. Первое разведение (1:50) делают при помощи пипетки—0,1 мл сыворотки + 4,9 мл физио­логического раствора. Дальнейшие разведения (1:100— 1:200 — 1 : 400—1:800) готовят по обычной схеме.

Берут 6 рядов пробирок по 6 пробирок в каждом. По 1 мл сыворотки разведения 1: 100 наливают в первую пробирку каждого ряда, 1: 200 — во вторую, 1 : 400 — в третью и т. д.; в шестую, контрольную, пробирку наливают 1 мл физиологического раствора.

Во все пробирки первого ряда добавляют по 1—2 капли брюшнотифозного Н-диагностикума; в пробирки второго ряда — брюшнотифозный 0-диагностикум; в пробирки третьего я четвертого ряда добавляют А-паратифозный, Н - и 0-диагностикумы, а в 5-й и 6-й ряд— В-паратифозный H - и 0-диагностикум. Пробирки ставят в термостат на 2 часа, отмечают результат реакции, затем оставляют при комнатной температуре на сутки; после этого срока дают заключение об окончательном результате реакции.

Возбудителем заболевания считается тот микроб, который агглютинируется сывороткой больного. Реакция считается положителыной, если агглютинация произошла хотя бы в первой пробирке с разведением 1: 100; обычно она наступает в больших разведениях. Если происходит групповая агглютинация с двумя или с тремя антигенами, то за возбудителя болезни принимается тот микроб, с которым произошла агглютинация в наиболее высоком разведении сыворотки.

РСК с целью серодиагностики сыпного тифа

Тип реакции - реакция связывания комплемента.

Исследуемый материал - парные сыворотки крови больного (сыворотки одного и того же больного, взятые у него с временным промежутком не менее 5-7 дней).

Диагностический препарат - сыпнотифозный антиген для РСК.

Дополнительные ингредиенты реакции: комплемент в рабочей дозе; гемолитическая сыворотка в рабочей дозе; эритроциты барана (3 % взвесь).

Положительная реакция - задержка гемолиза; отрицательная - гемолиз.

Диагностическим критерием является нарастание титра антител не менее, чем в 4 раза (во второй сыворотке по сравнению с первой).

Обычно реакцию применяют для ретроспективной диагностике.

В данном случае... (результат и вывод).

Реакции Вассермана (серодиагностика сифилиса)

Тип реакции: РСК.

Исследуемый материал: сыворотка обследуемого.

Диагностические препараты:

1. Неспецифический кардиолипиновый АГ (антиген) для реакции Вассермана - спиртовая липидная вытяжка из миокарда быка, обогащенная холестерином.

2. Специфический ультраозвученный трепонемный АГ – содержит АГ культуральных трепонем, разрушенных ультразвуком.

Дополнительные ингредиенты реакции: комплемент в рабочей дозе; гемолитическая сыворотка в рабочей дозе; эритроциты барана (3 % взвесь).

Положительная реакция - задержка гемолиза; отрицательная - гемолиз.

Качественный метод - сыворотку обследуемого вносят в 2 лунки, добавляют соответственно АГ 1 и АГ 2, а затем в обе лунки - дополнительные ингредиенты реакции. Применение: отбор лиц для постановки количественной реакции Вассермана.

В данном случае обследованы пациенты ... (результат, вывод).

Количественный метод - диагностика сифилиса, контроль эффективности терапии. Готовят разведения положительной сыворотки (по качественной реакции). К каждому разведению добавляют трепонемный ультраозвученный АГ (АГ2) и дополнительные ингредиенты реакции. Положительный результат - ЗГ (задержка гемолиза), отрицательный - Г (гемолиз).

Результат интерпретируют, основываясь на количестве антител.

В данном случае...(результат и вывод).

РСК с целью раздельного определения IgM и IgG

Тип реакции - реакция связывания комплемента.

Исследуемый материал - сыворотка крови больного (нативная и обработанная меркаптоэтанолом).

Диагностический препарат - известный антиген для РСК.

Дополнительные ингредиенты реакции: комплемент в рабочей дозе; гемолитическая сыворотка в рабочей дозе; эритроциты барана (3 % взвесь).

Положительная реакция - задержка гемолиза; отрицательная - гемолиз.

Принцип метода: при обработке сыворотки меркаптоэтанолом разрушаются IgM.

Следовательно, с обработаной сывороткой реакция идет только за счет IgG.

Постановка реакции: готовят разведения нативной и обработанной сывороток, добавляют диагностический препарат и дополнительные ингредиенты реакции.

Трактовка результатов: если с обработанной сывороткой реакция идет практически таком же титре, как с необработанной, значит она содержит преимущественно IgG Если в обработанной сыворотке титр антител резко снизился по сравнению с необработанной, значит она содержит преимущественно IgM.

В данном случае...(результат и вывод).