МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НАТИВНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Микроскопическое исследование спермы проводится после разжижения, но не позже одного часа после эякуляции. Если семенная жидкость при комнатной температуре не разжижается, ее необходимо поставить в термостат при температуре 37°С на несколько минут. Раз­жиженную сперму тщательно перемешивают пастеровской пипет­кой, избегая пенообразования. Одну каплю материала наносят на чистое сухое предметное стекло и покрывают покровным. Исследу­ет под микроскопом с увеличением 40x10 при полуопущенном конденсоре. В препаратах, приготовленных из нормальной спермы, видно большое количество подвижных сперматозоидов, имеющих грушевидную головку, шейку (тело) и хвост. Если в нативном препа­рате сперматозоиды не обнаруживаются, то эякулят центрифугиру­ют при 3000 об./мин в течение 10 мин, из полученного осадка готовят мазки.

При микроскопии устанавливают:

1. наличие или отсутствие сперматозоидов;

2. среднее количество сперматозоидов на одно поле зрения;

3. характер подвижности сперматозоидов;

4. наличие агглютинации (склеивание единичных сперматозоидов оценивается как (1+). Если склеена половина сперматозоидов, но только головками - как (2+), если половина сперматозоидов скле­ена головками и хвостами — как (3+), если склеены почти все сперма­тозоиды - как (4+). В нормальном эякуляте агглютинация не выявля­ется.)

Клетки сперматогенеза в нативном препарате плохо дифференци­руются, поэтому их исследуют только в окрашенном мазке. В нор­мальном эякуляте клетки сперматогенеза составляют 0,5—2% от коли­чества сперматозоидов.

Эритроциты в норме отсутствуют или единичные в препарате;

Лейкоциты в нормальном эякуляте бывают единичными в поле зрения;

Эпителиальные клетки в нормальном эякуляте могут быть обнару­жены в незначительном количестве. При воспалительных процессах их количество увеличивается;

Макрофаги обнаруживаются при воспалительных процессах и при застое спермы;

Липоидные тельца («лецитиновые зерна») — мелкие матовые обра­зования округлой формы, в нормальном эякуляте содержатся в зна­чительном количестве, отражают гормональную функцию простаты;

Амилоидные тельца (конкременты) имеют овальную или округлую форму, напоминают зерна крахмала, центральная часть их мелкозер­нистая желтого цвета. Обнаруживаются при застое секрета предста­тельной железы;

Кристаллы Беттхера - бесцветные удлиненной формы, образуются при охлаждении эякулята в случае недостаточного сперматогенеза или при простатите;

Слизь в нормальном эякуляте отсутствует.

Определение количества сперматозоидов.

Определение количества сперматозоидов в 1 мл и во всем эякуляте - подсчет обездвиженных сперматозоидов осуществляется в камере Горяева.

Реактивы для обездвиживания сперматозоидов.

1) 1,0 мл 40% нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды.

2) 1,0 мл формалина, 5,0 г бикарбоната натрия, вода до 100 мл.

3) Жидкость Рубенкова: 0,1 г основного фуксина, 0,02 мл краски Романовского, 0,2 мл концентрированной карболовой кислоты - 0,1 мл глицерина, 2 мл 96% этанола, 100 мл 9 г/л хлорида натрия. Эта жидкость окрашивает сперматозоиды, что позволяет наряду с подсчетом общего количества сперматозоидов изучить их морфологию.

Эякулят после перемешивания разводят в 20 раз раствором для обездвиживания сперматозоидов в пробирке. Тщательно перемешивают и заполняют заранее подготов­ленную счетную камеру Горяева. Через несколько минут производят подсчет сперма­тозоидов в пяти больших разграфленных квадратах, расположенных по диагонали при увеличении: окуляр 7, объектив 40 с опущенным конденсором. Подсчитывают только те сперматозоиды, головки кото­рых лежат внутри квадратов. Полученное число умножают на 106, в результате получают количество сперматозоидов в 1 мл эякулята, а затем умножают на объем эякулята и получают общее количество сперматозоидов.

В норме в 1 мл спермы содержится 60—120*10⁶ спер­матозоидов, во всем эякуляте количество сперматозоидов превышает 120*10⁶, в среднем 150-450*10⁶.

Определение подвижности сперматозоидов.

Подвижность в нормальной семенной жидкости очень активная и сохраняется до 24 часов при комнатной температуре. Кинезисграмма — это процентное соотношение сперматозоидов с различной подвижностью. Активно подвижные сперматозоиды обладают быстрым целесообразным поступательно-вращательным движением с перемещением в поле зрения. Малоподвижные сперматозоиды двигаются медленно, совершая колебательное, манежное движение или подергивание на месте. Неподвижные (мертвые) сперматозоиды не двигаются совсем.

Исследование проводят при температуре 20—25°С. На сухое предметное стекло наносят каплю перемешанного эякулята, покрывают покровным стеклом, избегая попадания пузырь­ков воздуха. Подсчитывают в нескольких полях зрения не менее 100 клеток, отмечая количество активноподвижных, малоподвижных и неподвижных. Рассчитывают процентное соотношение спермато­зоидов с различной подвижностью.

Для общей визуальной оценки можно использовать шкалу в бал­лах: 4 — активная подвижность (все сперматозоиды обладают прямо­линейной подвижностью со значительной скоростью), 3 — хорошая подвижность (большинство сперматозоидов обладает прямолиней­ной подвижностью, но она несколько снижена), 2 — посредственная подвижность (небольшое количество двигается поступательно), 1 - плохая подвижность (поступательное движение сперматозоидов отсутствует), 0 - полное отсутствие движения сперматозоидов.

В норме активно подвижные сперматозоиды составляют от 60 до 80-90%, малоподвижные – 10-20%, неподвижные – не более 10%.

Определение мертвых и живых сперматозоидов:окрашивание по Блуму

На предметное стекло наносят каплю спермы, рядом две капли водного раствора кислого (50 г/л) эозина, капли смешивают, через несколько секунд добавляют каплю водного раствора нигрозина (100 г/л), перемешивают и через несколько секунд делают тонкий мазок при помощи шлифованного стекла. Мазок высушивают и иссле­дуют с помощью иммерсионного объектива. Подсчитывают не менее 200 клеток, выделяя отдельно живые и мертвые сперматозоиды. Мер­твые сперматозоиды окрашены в красно-фиолетовый цвет, живые - бесцветные.

В нормальном эякуляте живые сперматозоиды составляют 90—95% от общего количества.

Стимуляция подвижности сперматозоидов («оживление»)

При обнаружении в эякуляте большого количества живых сперматозоидов при плохой подвижности, проводят пробу с «оживляющим» раствором (например, с раствором кофеина 1,0 г/л). Эякулят разбавляют «оживляющим» раствором 1:9, помещают в термостат при температуре 37^о на 60 минут. После инкубации подсчитывают процент подвижности сперматозоидов.

В норме не менее 60% сперматозоидов активно подвижны.

МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОКРАШЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

(окраска по Паппенгейму)

На мазок наносят раствор краски-фиксатора Мая—Грюнвальда на 3 мин. Затем препарат ополаскивают водой и заливают на 5—10 мин рабочим раствором краски Романовского. Препарат промывают проточной водой, высушивают и исследуют сиспользованием иммерсионной системы.

В окрашенном препарате подсчитывают не менее 200 сперматозо­идов и выражают в процентах количество нормальных и патологиче­ских форм, количество клеток сперматогенеза.

1. Молодые или незрелые формы сперматозоидов имеют вокруг головки и шейки остаток цито­плазмы («воротничок» или «капюшон»), наблюдаются при частых половых сно­шениях и неспособны к оплодотворению. В норме незрелые сперматозоиды вставляют не более 2%.

2. Старые формы сперматозоидов с гиперхромией, ахромией, вакуолиза­цией головки появляются в семенной жидкости после продолжительного полового воздержания и непригодны для оплодотворения. В нормальном эякуляте их не более 4%.

3. К патологическим формам относят сперматозоиды: макро-, микро-, кони­ческие головки, клювовидные, двугла­вые с одной шейкой и хвостом, с раздво­енными головками, без шейки, с утол­щенной, изогнутой шейкой, с несколь­кими хвостами, без акросомы или без ядра и др. У здоровых мужчин с нормальной спермой патологические формы спер­матозоидов обычно не встречаются, но их количество при нормоспермии может достигать не более 20%. Среди патологических форм нормального эякулята 10-15% приходится на патоло­гию головки, 2-5% - тела, 2-9% - хво­ста.

Клетки сперматогенеза в нормальной сперме составляют 0,5—2% по отношению к количеству сперматозоидов, сперматогониив норме не обнаружива­ются, встречаются обычно сперматиды.

Микроскопическое исследование спермы выявляет следующие состояния: аспермия— отсутствие в сперме сперматозоидов и клеток сперматогенеза; азооспермия — отсутствие сперматозоидов при нали­чии клеток сперматогенеза; астеноспермия— характеризуется сниже­нием процента активноподвижных сперматозоидов; олигозооспермия — уменьшение количества сперматозоидов в 1 мл эякулята; тератоспермия - увеличение процента патологических форм сперматозо­идов; некроспермия — увеличение количества мертвых сперматозои­дов; акинезис — состояние, при котором неподвижные сперматозоиды после «оживления» начинают двигаться.