Пиши Дома Нужные Работы

Обратная связь

Итоговое контрольное занятие «Общая вирусология и генетика».

План занятия:

1.Культивирование вирусов в культурах тканей (окончание):

а) изучение цитопатического эффекта - макро- и микроскопии культур клеток, зараженных вирусом осповакцины;

б) выявление размножения вирусов в культуре ткани реакцией гемадсорбции (демонстрация готовых препаратов);

в) обнаружение вируса в культуре ткани методом цветной пробы (демонстрация);

г) выявление вируса в культуре ткани методом бляшек (демонстрация);

д) обнаружение вируса в культуре ткани с помощью флуоресцирующих антител. Разбор методики.

2. Культивирование вирусов в курином эмбрионе (окончание):

а) вскрытие зараженных куриных эмбрионов и изучение изменений в них;

б) постановка реакции гемагглютинации;

в) определение типа вируса гриппа в аллантоисной жидкости с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

3. Итоговый контроль по теме «Общая вирусология и генетика МО».

 

Методические указания

1. а) Цитопатический эффект - дегенерация клеток, возникающая под действием размножающегося в культуре ткани вируса. Микроскопически цитопатическое действие выражается в различных изменениях морфологии клеток, образовании гигантских многоядерных клеток (симпластов), пикнозе ядер и, наконец, в полной деструкции клеток. Макроскопически заметно слущивание клеток со стенок пробирки. Характер клеточной дегенерации зависит, в основном, от вида вируса.

Промикроскопировать культуру ткани, зараженную вирусом осповакцины. Зарисовать.

б) Гемадсорбция – адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток.

Методика реакции. В пробирки о зараженной вирусом культурой ткани вносят 0,2 мл 0,4% взвеси эритроцитов. Пробирки встряхивают и оставляют в наклонном положении. Длительность контакта эритроцитов с клетками зависит от температуры инкубация и вида вируса. Учёт реакции производят под малым увеличением микроскопа после непродолжительного покачивания пробирки для отделения неадсорбированных эритроцитов от поверхности клеток. При вирусной гемадсорбции эритроциты прочно фиксированы на клетках и сохраняются на них после 1-2-кратного отмывания. Адсорбируясь на поверхности пораженных вирусом клеток, эритроциты образуют характерные скопления.



Зарисовать картину гемадсорбции.

Культура клеток, зараженная вирусом _______________ (цитопатический эффект) окраска по Романовскому Реакция гемадсорбции окраска по Романовскому

 

в) Цветная реакция. В основу реакции положено то обстоятельство, что в процессе размножения и роста клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты обмена веществ, снижающие рН среды. В ткани, зараженной вирусом, наступает дегенерация клеток, в силу чего подавляется их метаболизм и не происходит изме­нение рН среды. Для выявления этих изменений в питательную среду добавляют индикатор феноловый красный. При рН выше 7 цвет индикатора красный, при рН 7 – оранжевый и при рН ниже 7 – желтый.

Если клетки не заражены вирусом (или он нейтрализован специфической сывороткой), рH питательной среды сдвигается в кислую сторону, и она становится желтой. В случае размножения вируса клетки дегенерируют, и среда сохраняет исходный красный цвет.

Метод цветных проб может быть использован для титрования ви­руса или вируснейтрализирующих антител.

Цветные пробы зарисовать.

г) Метод бляшек предложен Р. Дюльбекко для получения изолированных колоний вируса. В основе метода лежит появление в монослое зараженных вирусом клеток обесцвеченных участков, состоящих из дегенерированных клеток. Эти участки, получившие название бляшек, представляют собой колонии вируса, образующегося из одной вирусной частицы.

Метод заключается в следующем. В специальном флаконе на стенке выращивают монослой клеток, затем удаляют питательную среду. Клетки заражают вирусом и заливают агаром, содержащим индикатор нейтральный красный. Там, где происходит рост клеток, среда изменится в кислую сторону, и индикатор окрасится в розовый цвет. На тех участках, где клетки погибли под действием вируса, рН среды и, следовательно, цвет индикатора не изменяется. Такие островки неокрашенной среды имеют вид беловатых бляшек разной формы и величины, что зависит от вида вируса.

Феномен бляшкообразования зарисовать.

 

Метод цветных проб: 1 – культура ткани, не заражённая вирусом; 2– культура ткани, заражённая вирусом Культура ткани, заражённая вирусом полиомиелита (феномен бляшкообразования)

 

д) Метод флуоресцирующих антител основан на появлении специфического свечения в местах локализации вируса при обработке зараженной ткани флуоресцирующими антителами. Заражаемую культуру ткани выращивают на стеклянных пластинках. Препарат промывают физиологическим раствором, подсушивают и фиксируют в ацетоне при 4°С в течение 10 мин. Затем препарат окрашивают специфической флуоресцирующей сывороткой в течение 30 мин при 37°С. После окраски препарат промывают физиологическим раствором и высушивают. Просмотр препарата производят с помощью люминесцентного микроскопа.

2. а) Вскрытие куриных эмбрионов. Работу проводят в стерильных условиях. Яйцо ставят воздушным мешком кверху, место вскрытия смазывают спиртом, йодом, еще раз спиртом, обжигают, снимают колпачок и ножницами удаляют прилегающую к отверстию часть скорлупы. Пинцетом снимают подскорлупную обо­лочку, прокалывают пастеровской пипеткой хорионаллантоисную обо­лочку и из полости отсасывают аллантоисную жидкость, содержащую вирус. Жидкость помещают в стерильную пробирку.

Для исследования хорионаллантоисной оболочки из яйца удаляют всё содержимое. Оболочка остается на внутренней поверхности скорлупы или выпадает вместе с содержимым яйца. Оболочку осторожно вынимают пинцетом, помещают в чашку Петри, промывают физиологиче­ским раствором, тщательно расправляют и рассматривают на темном фоне изменения, имеющиеся в ней. Изменения на оболочке строго специфичны. Например, вирус осповакцины вызывает образование многочисленных беловатых втянутых в центре бляшек.

б) Реакция гемагглютинации. Аллантоисную жидкость проверяют на содержание вируса путем агглютинации куриных эритроцитов на стекле (и в пробирках - титрование вируса). Для постановки реакции на стекле к капле вируссодержащего материала добавляют одну каплю 5% взвеси эритроцитов. Реакция проходит в течение 5 мин.

 

Реакция гемагглютинации

  1 – опыт (к капле аллантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа, добавляют каплю 5% взвеси куриных эритроцитов) 2 – контроль (эритроциты + физ. р-р).

в) Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) может быть использована для определения типа ви­руса или типа и титра антител. Для определения типа вируса на пред­метное стекло наносят по одной капле вирусосодержащего материала (количество капель должно соответствовать количеству сывороток). В приготовленные капли последовательно вносят по одной капле типовых сывороток. Контролем служит физиологический раствор и нормальная сыворотка. Затем в каждую каплю вносят по одной капле 5% взвеси эритроцитов. Результат регистрируют через 5 мин. При соответствии вируса типу сыворотки антитела связывают гемагглютинин вируса, и гемагглютинация не наступает (РТГА положительная). Эта реакция может быть поставлена и в пробирках с целью титрования вируса или анти­тел (антигемагглютининов).

 

Схема определения типа вируса реакцией торможения гемагглютиниции.

В каплю вируссодержащей жидкости добавляют каплю типовой сыворотки и каплю 5% взвеси эритроцитов. К– контроль (эритроциты + физ. раствор).
Заключение:__________________________________________________________ _____________________________________________________________________  

Контрольные вопросы

Как обнаруживают наличие вируса в культуре ткани?

Почему при размножении вируса цвет среды не изменяется?

С какой целью может быть использован метод цветных проб?

Какие изменения наступают в клетках при размножении вируса?

Как ставят реакцию гемадсорбции? Как выглядит положительная реакция гемадсорбции?

Что собой представляет метод бляшек?

Как обнаруживают вирус гриппа в курином эмбрионе?

Как вскрывают зараженный эмбрион?

Почему происходит реакция агглютинации эритроцитов в присутст­вии вируса гриппа? Каков механизм этой реакции?

Что такое реакция торможения (нейтрализация) гемагглютинации? Для чего она используется?

Как обнаруживают изменения в хорионаллантоисной оболочке, вы­званные вирусом?

 

Приложение к ЗАНЯТИЮ 9.






ТОП 5 статей:
Экономическая сущность инвестиций - Экономическая сущность инвестиций – долгосрочные вложения экономических ресурсов сроком более 1 года для получения прибыли путем...
Тема: Федеральный закон от 26.07.2006 N 135-ФЗ - На основании изучения ФЗ № 135, дайте максимально короткое определение следующих понятий с указанием статей и пунктов закона...
Сущность, функции и виды управления в телекоммуникациях - Цели достигаются с помощью различных принципов, функций и методов социально-экономического менеджмента...
Схема построения базисных индексов - Индекс (лат. INDEX – указатель, показатель) - относительная величина, показывающая, во сколько раз уровень изучаемого явления...
Тема 11. Международное космическое право - Правовой режим космического пространства и небесных тел. Принципы деятельности государств по исследованию...



©2015- 2024 pdnr.ru Все права принадлежат авторам размещенных материалов.