Бактеріофаг, його природа і практичне застосування. Вплив бактеріофага на мінливість мікроорганізмів.

Бактеріофаги— це віруси, які паразитують на бактеріях і здатні спричиню-вати їх лізис .

Пріоритет у відкритті бактеріофага (1917) належить канадському вченому Феліксу д'Ереллю, який працював в Інституті Пастера у Парижі. Вивчаючи дизен-терію, він замислився над тим, чому на початку захворювання збудник хвороби висівається з випорожнень хворого у великій кількості, а наприкінці захворювання — не висівається. Він запідозрив появу якогось агента, який знищував збудника дизентерії. Щоб виявити його, Ф. д'Ерелль кожного дня вносив у пробірки із засія-ною культурою збудників дизентерії фільтрат випорожнень хворого. Після інкубації в термостаті культура виростала. Але коли хворий почав одужувати, культура збуд-ників дизентерії під впливом фільтрату випорожнень розчинилася, при чому лізуюча здатність фільтрату випорожнень посилювалася під час послідовних пасажів на свіжих культурах бактерій. З цього вчений зробив висновок, що лізис бактерій спричинює живий агент, здатний проникати через бактеріальний фільтр, тобто вірус. Д'Ерелль назвав його „ той, що поїдає бактерії і виділений з кишечнику”.

Пізніше були відкриті віруси, здатні руйнувати клітини синьо-зелених водоростей, актиноміцетів. Тому цю групу вірусів стали називати фагами .За своєю природою це живі організми. Вони здатні розмножуватися, змінюватися під впливом факторів навколишнього середовища, адаптуватися до інших видів мікробів, передавати у спадок свої властивості. Фаги інфікують і руйнують тільки молоді клітини мікроорганізмів, вони є облігатними внутрішньодноклітинними паразитами мікроб-них клітин.

Як в усіх вірусів, віріони фагів складаються з білкової оболонки — капсиду і нуклеїнової кислоти . У більшості фагів розрізняють головку і хвостовий відросток. У деяких фагів відросток дуже короткий або взагалі відсутній. За формою фаги бувають: ниткоподібні, сферичні та сперматозоїдні. За розміром — дрібні, серед-нього розміру і великі. Розмір фагової часточки коливається від 20 до 200 нм. Діаметр головки в середньому становить 60—100 нм, довжина відростка — 100—200 нм. Нуклеїнова кислота може бути представлена РНК, одно- та дво-нитковою ДНК. Найбільше вивчені Т-фаги . Вони утворюють Т-групу колі-дизентерійних фагів: непарні - Т_х, Т₃, Т₅, Т₇ і парні - Т₂, Т₄, Т₆. Найбільш складну структуру мають Т-парні фаги, а конкретно саме Т₂.

У фага Т₂ капсид головки шестигранної форми, капсомери в ній розміщені за кубічним типом симетрії. Капсид чохла відростка має циліндричну форму, капсо-мери в ньому розміщені за спіральним типом симетрії. На кінці відростка є шести­кутна базальна пластинка, в кутах якої розміщені зубці і фібрили. У головці фага міститься двониткова суперспіралізована ДНК, на вільному кінці відростка — фермент лізоцим.

Фаги більш стійкі до фізичних і хімічних факторів навколишнього середовища, ніж вегетативні форми бактерій, у яких вони розмножуються. Фаги витримують нагрівання до 75 °С, заморожування, висушування, коливання рН від 5,0 до 8,5, не чутливі до антибіотиків, хлороформу, фенолу, розчинів гліцерину й етилового спирту. Ці фактори використовують для виділення фагів. На фаги згубно діють кислоти, формалін, ультрафіолетове та іонізуюче радіаційне випромінювання.

Зберігають фаги у запаяних ампулах у рідкому і ліофілізованому стані протягом 5—6 і навіть 13 років за температури 6±4 °С у місці, захищеному від світла.

Фаги здатні розмножуватися в клітинах певного виду бактерій, що зумовлено наявністю рецепторів у фагів і на оболонці відповідних мікробних клітин. Тому в основу номенклатури фагів покладена видова назва мікроба-хазяїна: дизентерійні фаги, стафілококові, сальмонельозні, дифтерійні та ін.

За специфічністю розрізняють: видові фаги, які паразитують у клітинах тільки одного виду бактерій (холерний, дифтерійний); полівалентні, що паразитують у клітинах близьких видів бактерій, які належать до одного роду (полівалентний дизентерійний фаг); типові, які паразитують у клітинах окремих варіантів одного виду мікроорганізмів (стафілококові, черевнотифозні). Типові фаги на зивають літерами латинського алфавіту або цифрами. За допомогою типових фагів проводять найбільш детальну диференціацію бактерій всередині одного виду, поділяючи їх на фаговаріанти, що має важливе діагностичне й епідеміологічне значення.

Розрізняють фаги інфекційні — здатні проникати у мікробну клітину, і неінфекційні, або незрілі, — це фаги, що перебувають у стадії розмноження.

Інфекційні фаги, в свою чергу, поділяють на вірулентні — здатні репродукува-тися в мікробній клітині і спричинювати її лізис, і помірні — здатні проникати в мі­кробну клітину й інтегрувати в її геном. Поза живою клітиною фаги перебувають у стадії спокою.

Життєвий цикл фага може проявлятися у формі продуктивної, редуктивної й абортивної інфекції.

Продуктивну інфекцію спричинюють вірулентні фаги. При цьому життєвий цикл фага складається з 6 послідовних стадій :

І —адсорбція на поверхні чутливої клітини за допомогою хвостового відростка. Вона відбувається, якщо фагові рецептори відповідають рецепторам клітинної стінки бактерій; на протопластах (клітинах, що повністю втратили клітинну стінку) фаги не адсорбуються. На адсорбцію фага впливають хімічний склад середовища, рН, температура;

II — проникнення нуклеїнової кислоти фага в бактеріальну клітину (оболонка фага залишається поза клітиною і називається "тінню" фага);

III — реплікація фагової нуклеїнової кислоти;

IV — синтез білкової оболонки фага і фагоспецифічних ферментів;

V — формування нових часточок фагів;

VI — вихід сформованих фагів із клітини відбувається за раху­нок лізису із середини вільним лізоцимом — шлях "вибуху". Деякі ДНК-геномні фаги вивільняються із клітини шляхом "просочування" через цитоплазматичну мембрану і клітинну стінку, під час якого утворюється їхній капсид. Бактеріальна клітина при цьому залишається життєздатною.

З однієї фагової часточки синтезується 200—300 нових фагів. Цикл репродукції фагів відбувається дуже швидко. Вже через 13 хв після проникнення фага в чутливу клітину з'являються нові піріони.

Якщо на клітині адсорбується велика кількість фагових віріонів, то може відбу-ватися лізис і ззовні. Репродукція фага при цьому не нідбувається. Редуктивну інфекцію спричинюють тільки помірні фаги. У цьому разі життєвий цикл фага скла-дається з таких стадій:

I — адсорбція фага на поверхні чутливої клітини;

II — проникнення фагової нуклеїнової кислоти в бактеріальну клітину;

III — інтеграція фагової нуклеїнової кислоти в хромосому клітини — фагова нукле-їнова кислота стає складовою частиною геному клітини-хазяїна, утворюючи єдину хромосому, і називається профагом.

Явище симбіозу профага і бактеріальної клітини називається лізогенією, а культура мікроорганізмів, що містить профаг, — лізогенною. Ця назва відображає потенційну здатність лізогенних клітин до лізису у разі вивільнення профага із складу бакте-ріального геному і перетворення його на вірулентний фаг. Лізогенна клітина не гине, вона розмножується, а профаг передається у спадок її дочірнім клітинам. Разом із профагом бактеріальна клітина може отримати гени, що несуть інформацію про будь-які властивості (наприклад, тох-ген надає мікробній клітині властивість продукувати екзотоксин — збудник дифтерії). Таку форму мінливості називають лізогенною, або фаговою, конверсією, а здатність фага переносити гени — транс-дукцією.

Виходу профага із хромосоми клітини заважає білок-репресор, синтез якого контролюється фагом. Лізогенна культура набуває імунітету щодо проникнення в неї інших часточок цього фага. У разі дії на лізогенну культуру суббактерицидних доз рентгенівського, ультрафіолетового, космічного випромінювань, хімічних речовин Та інших факторів, що інактивують білок-репресор, профаг може німіти із хромосоми, перетворитися на вірулентний фаг і спричинити- продуктивну інфекцію — лізис бактеріальної клітини. Помірні фаги можуть бути дефектними, тобто не здатними давати фагове потомство. Такі фаги використовують для трансдукції в генній інженерії.

При абортивнійінфекції взаємодія фага з мікробною клітиною переривається на будь-якій стадії його життєвого циклу і він гине.

Фаги дуже поширені у природі. їх виявляють в організмах людей, тварин і їх випорожненнях, у воді річок і морів; особливо багато їх у стічних водах, де є відпо-відні бактерії, у ґрунті, повітрі, музейних культурах. Фаги виділяли із тканин пух-лин, що утворюються нарослинах, із овочів, фруктів, молока.

Джерелом фагів проти патогенних мікробів є хворі люди і тварини, носії і реконвалесценти, об'єкти навколишнього середовища. У людей фаги виділяли з випорожнень, сечі, крові, мокротиння, слини, гною, виділень із носа.

Виділення фагів патогенних мікробів із ґрунту, води вказує на те, що в цій місцевості є хворі люди чи тварини, які їх виділяють у довкілля. Виявляють фаги в об'єктах навколишнього середовища за допомогою реакції наростання титру специфічного фага (РНТФ).

Добувають фаги із фільтрату матеріалу, що досліджується, або із бульйонної культури мікроорганізмів, до якої додають виробничий фаг і інкубують за темпе-ратури 37 °С протягом 1 доби. За цей час кількість фагових часточок різко збільшу-ється. Потім цю культуру фільтрують через бактеріальний фільтр. Фільтрат переві-ряють на чистоту, стерильність, нешкідливість і активність фага.Наявність вірулент-ного фага виявляють за його здатністю спричинювати лізис тест-культури. Методи виявлення фагів бувають якісні і кількісні.

Якісневиявлення фагів проводять на щільному поживному середовищі, засіяному тест-культурою. Фаг спричинює появу стерильних (прозорих) плям у тому місці, де був нанесений специфічний фаг. Ці стерильні плями називають негативними коло-ніями фага. У рідкому поживному середовищі вірулентий фаг зумовлює відсутність росту культури (бульйон залишається прозорим) або розчинення культури (просвітління бульйонної культури мікроорганізмів).

Кількісневизначення фага (визначення його активності) проводять за методами Аппельмана або Граціа. Титр фага за Аппельманом — це найбільше його розведення (або найменша концентрація), при якому фаг пригнічує ріст тест-культури в умовах досліду. Титр позначають цифрою, що вказує на ступінь розведення фага. Найчасті-ше використовують фаг у титрі 10~⁴. Титр фага за Граціа — це кількість часточок фага в 1 см³ матеріалу, що досліджується (наприклад, 32 • 10⁷).

Враховуючи літичну дію фагів на бактерії, їх використовують для лікуваннярізних хвороб травного тракту, запальних хвороб носа,ротової порожнини, верхніх дихальних шляхів, сечостатевої і истоми, холециститів тощо.

Фаги не токсичні, не мають протипоказань до застосування, побічні реакції не зареєстровані. їх молена використовувати разом її будь-якими іншими лікувальними препаратами, в тому числі й .мі гибіотиками. Можна призначати вагітним жінкам, дітям будь-якого віку, навіть недоношеним. Це дає змогу використовувати фагине тільки для лікування, а й для профілактики інфекційних :захворювань. Основною умовою успішного використання фага для лікування і профілактики хвороб є пере-вірка виділеної культури на чутливість довідповідного фага. Препарати фага призначають перорально при захворюваннях внутрішніх органів; у вигляді високої клізми, ішедення в пазухи та порожнини носа, середнього вуха, черевну, плевральну, сечового міхура, матки, піхви, абсцесу або місцево для оброблення гнійних ран у вигляді зрошування. Дія фага проявляється через 2—4 год після введення. Фаги легко проникають у кров, лімфу, виводяться через нирки і санують сечові шляхи. Найбільше практичне значення для лікування і профілактики мають бактеріофаги: колі-протейний, сальмонельозний, полівалентний дизентерійний, стафілококовий, стрептококовий, полівалентний бактеріофаг клебсієл. Препарати цих фагів випускають у рідкому стані, в таблетках з кислотостійким покриттям, у формі свічок. Вони зберігаються за температури 2—10 °С у сухому, захищеному від світла місці. Після закінчення терміну придатності використання їх неприпустиме.

Фаги використовують для діагностикиінфекційних хвороб з ме­тою ідентифікації культури (холерний, чумний фаги).Фаготипуваннядає змогу визначити фаговаріант культури, а нідтак, встановити джерело інфекції.

За допомогою тест-культури визначають вид невідомого фага, а ;іа реакцією РНТФ — санітарно-епідемічний стан довкілля без виділення культури збудника.

Бактеріофаги непатогенних ешерихій (коліфаги) використовують як найбільш ефективний індикатор вірусного забруднення водних об'єктів.

Питання для самоконтролю.

1. Що вивчає генетика мікроорганізмів? Що таке спадковість, мінливість, ген, генотип, фенотип?

2.Які бувають гени за хімічним складом, за функцією?

3.Що таке оперон? Яка його структура?

4..Які фактори спричинюють мінливість мікроорганізмів? Що таке "дисоціація" бактерій?

5.Які бувають форми мінливості?

6.Які фактори спричинюють появу модифікацій? У чому вони проявляються?

7.Що таке генотипова мінливість? Як вона проявляється?

8.Які бувають мутації за походженням, за величиною змін у геномі, за фенотиповими наслідками?

9.Що таке генетичні рекомбінації? У чому полягає суть трансформації?

10.Що таке трансдукція? Які її види? Що таке фагова (лізоген-на) конверсія?

11.Що таке кон'югація? Як вона відбувається?

12.Які фактори належать до позахромосомних факторів спадковості? Чим вони схожі між собою і чим відрізняються?

13.Що таке плазміди? Які існують категорії плазмід?

14.Яку роль у бактеріальній клітині відіграють Б¹-, К-плазміди, плазміди патогенності, бактеріоциногенності?

15. Що таке транспозони, інсерційні послідовності? Чим вони подібні до плазмід, між собою і чим вони відрізняються?

16. У чому полягає особливість генетики вірусів?

17. Яке практичне значення має вчення про генетику мікробів?

18. Що таке бактеріофаг (фаг)?

19. Яка структура і хімічний склад віріону фага?

20. Яка резистентність фага до факторів навколишнього сере­довища

21. Чим пояснюється специфічність фага? Які бувають фаги за спектром дії на бактерії?

22. Які фаги називають інфекційними, неінфекційними?

23. Які інфекційні фаги називають вірулентними? Які — помірними? Що таке дефектні фаги?

24. Які стадії характерні для життєвого циклу фага при продуктивній, редуктивній та абортивній інфекції?

25. Що таке лізогенія, лізогенна культура, лізогенна конверсія?

26. Якими методами виявляють фаг? Як визначають активність фага? В яких одиницях її вимірюють?

27. Де застосовують фаги? У чому перевага фаготерапії?

Тести.

1. За хімічною структурою ген — це:

а) ділянка молекули ДНК, у якій зашифрована генетична інформація;

б) ділянка молекули РНК, у якій зашифрована генетична інформація;

в) обидві відповіді правильні.

2. Повний набір генів бактеріальної клітини складає її:

а) генотип;

б) фенотип;

в) обидві відповіді правильні.

3. Для лікування інфекційних хвороб використовують фаги:

а) вірулентні;

б) помірні;

в) неінфекційні;

г) всі відповіді правильні.

4. Передача генів від однієї бактеріальної клітини до іншої шляхом поглинання фрагмента чужорідної ДНК із зовнішнього середовища називається:

а) трансформацією;

б) трансдукцією;

в) кон'югацією.

5. Позахромосомні фактори спадковості, що здатні до самореплікації, називають:

а) транспозонами;

б) плазмідами;

в) інсерційними послідовностями.

6.Лізогенна культура бактерій — це:

а) культура, яку розчинює вірулентний фаг;

б) культура, в якій знаходиться фаг;

в) культура, в якій міститься помірний фаг і яка може розчини­тися за певних умов.

7.Редуктивну інфекцію спричинюють фаги:

а) вірулентні;

б) помірні;

в) фаги, які перебувають у стані спокою.

8.Для виявлення джерела інфекції використовують фаги:

а) видові;

б) полівалентні;

в) типові;

г) всі відповіді правильні.

9. Лізогенна конверсія виникає внаслідок:

а) трансдукції;

б) трансформації;

в) кон'югації;

г) всі відповіді правильні.

Ситуаційні задачі.

1. Під час санітарно-мікробіологічного дослідження питної води виявили колі-фаги. Який висновок слід зробити про санітарно-епідемічний стан цієї води?

2. Під час ідентифікації культури бактерій було встановлено, що за культуральними, морфологічними, тинкторіальними, біохімічними властивостями її можна віднести до виду Е. соїі, але деякі антигени виявилися відсутніми. Яким чином можна відновити втрачені властивості цього штаму бактерій?

3. Еубіотик колібактерин виготовляють із живих ліофілізованих кишкових паличок. Чим пояснити здатність колібактерину пригнічувати умовно-патогенну мікрофлору?

4. Останнім часом більше ніж у 90 % штамів стафілокока виявлено резистентність до пеніциліну. Яка причина формування таких штамів?

1. У лізогенної культури збудника дифтерії виражена здатність виробляти екзотоксин. Чи є у культури ймовірність набувати і втрачати цю властивість?