Структура та функції мієліну

Міністерство освіти і науки україни

Дніпропетровський національний університет

імені Олеся Гончара

Факультет біології, екології та медицини

Кафедра біофізики та біохімії

ДИПЛОМНА РОБОТА МАГІСТРА

на тему: «БІОХІМІЧНА ВІДПОВІДЬ ОЛІГОДЕНДРОЦИТІВ ДО ІШЕМІЧНОГО СТАНУ»

Виконав: студент VI курсу, групи БХ-14м

спеціальності 8.04010205 «Біохімія»

________ Жданкін А.Є.

Керівник__________ д.б.н., проф. Ушакова Г. О.

підпис наук. вчене (прізвище та ініціали)

ступ. звання

Рецензент __________ к.б.н., проф. Мурзін О. Б.

підпис наук. вчене (прізвище та ініціали)

ступ. звання

Допускається до захисту:

зав. каф. біофізики та біохімії,

докт. біол. наук, професор

______________Ушакова Г. О.

Дніпропетровськ

РЕФЕРАТ

Біохімічна відповідь олігодендроцитів до ішемічного стану

Дипломна робота магістра містить: 62 ст., 17 рис., 74 джерела.

Об'єкт дослідження: головний мозок білих щурів лінії Вістар. Предмет дослідження – cтан мієлінової оболонки головного мозку гризунів.

Мета роботи: вивчити стан мієлінової оболонки в головному мозку ссавців на початкових етапах постнатального розвитку; оцінити біохімічну відповідь олігодендроглії до ішемічного стану мозку.

Методи: гомогенізація різних відділів головного мозку; отримання мембранної та цитозольної фракцій шляхом диференціального центрифугування гомогенатів мозку; визначення вмісту основного білка мієліну за допомогою непрямого імуноферментного аналізу; визначення вмісту загального протеїну за методом Бредфорд; статистичні методи обробки даних.

Одержані результати та їх новизна. Вперше досліджено вплив глобальної ішемії на розподіл основного білка мієліну у різних відділах головного мозку. Оцінено вплив ізадрину та пітуїтрину на вміст загального протеїну у цитозольних фракціях мозку. Вивчено розподіл основного білка мієліну протягом раннього постнатального розвитку.

Встановлено, що за умов глобальної ішемії у всіх відділах головного мозку, окрім кори великих півкуль, спостерігається тенденція до зниження вмісту загального протеїну та основного білка мієліну, що свідчить про демієлінізацію нервових волокон та зниження функціональної активності олігодендроглії. Нейропротекторні препарати Корвітин та альфа-кетоглутарат не повністю відновлюють уражені ішемією ділянки мозку. Результати дослідження можуть бути застосовані при терапії ішемічних уражень мозку різної етіології.

Ключові слова: ОСНОВНИЙ БІЛОК МІЄЛІНУ, ЗАГАЛЬНИЙ ПРОТЕЇН, ОЛІГОДЕНДРОЦИТИ, ІШЕМІЯ, РАННІЙ ПОСТНАТАЛЬНИЙ РОЗВИТОК.

RESUME

Oligodendrocytes' biochemical response to the ischemic condition

Master's work contains 62 p., 17 fig. and 74 sources.

Object of study: Wistar rat brain. The subject of study is a state of the myelin sheath in the rodent brain.

Purpose of the work:to study stage of myelin sheath in the mammal brain during the early stages of postnatal development; to evaluate a biochemical response of oligodendroglia to the ischemic brain condition.

Methods: brain homogenization; membrane and cytosolic fractions' receiving by differential centrifugation of brain homogenates; MBP- determining using indirect ELISA; determination of total protein by the Bradford method; statistical methods of data processing.

The results and their novelty.At first time the impact of global ischemia on myelin basic protein distribution in different parts of the brain was studied. The effects of Isadrinum and Pituitrinum on total protein content in brain cytosolic fractions were evaluated. The distribution of myelin basic protein during the early postnatal development was indicated.

The tendency to reduction of total protein and myelin basic protein under global ischemia conditions was established in the different parts of brain, besides the cerebral cortex. It suggests the demyelination of nerve fibers and reduction of oligodendroglial functional activity. Neuroprotective drugs, Corvitin and 2-oxoglutarate don't fully restore the affected brain parts after ​​the ischemia. Results of the study can be applied in the treatment of ischemic brain lesions of various etiologies.

Key words: MYELIN BASIC PROTEIN, TOTAL PROTEIN, OLIGODENDROCYTES, ISCHEMIA, EARLY POSTNATAL DEVELOPMENT.

ЗМІСТ

ВСТУП………………………………………………………………………………..5

1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ:

1. 1. Структура та функції мієліну…………………………………………………6

1. 2. Мієлінізація протягом постнатального розвитку гризунів………………….9

1. 3. Структурно-функціональні зміни олігодендроглії за ішемічного стану мозку:

1. 3. 1. Типи ішемії……………………………………………………………..12

1. 3. 2. Вплив гіпоксіє-індукованого фактору на стан мієліну………………13

1. 3. 3. Вплив ішемії мозку на експресію основного білка мієліну…………16

1. 3. 4. Дегенерація олігодендроцитів та їх відновлення після фокальної ішемії мозку………………………………………………………………….17

1. 3. 5. Енергетичний дефіцит олігодендроцитів за умов ішемії……………24

2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ:

2. 1. Об'єкт дослідження…………………………………………………………..27

2. 2. Ізадрин-пітуітринова модель ішемії…………………………………………27

2. 3. Отримання білкових фракцій з мозку піддослідних тварин……………….28

2. 4. Непрямий імуноферментний аналіз………………………………………….29

2. 5. Визначення вмісту загального протеїну за методом Бредфорд……………31

2. 6. Статистична обробка отриманих даних……………………………………32

3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ:

3.1. Основний білок мієліну протягом раннього постнатального розвитку………………………………………................................................33

3.2. Загальний протеїн протягом раннього постнатального розвитку………………………………………………………………………35

3.3. Загальний протеїн за умов ішемії ………………………………….............38

3.4. Основний білок мієліну за умов ішемії ……………………………………46

ВИСНОВКИ………………………………………………………………….53

Список бібліографічних посилань………………………………………………...54

ВСТУП

Мієлінова оболонка – це комплекс ліпідних та білкових компонентів, утворений мембранами гліальних клітин, сконцентрованих навколо аксонів нейронів. Відкриття мієліну приписують видатному вченому німецькому Рудольфу Вірхову (1854 р.), який використовував методи світлової мікроскопії для вивчення структури тваринних тканин. Детальне вивчення мієлінової оболонки аксонів дозволило з'ясувати механізми процесу передачі нервових імпульсів. Функціями мієлінової оболонки є: прискорене проведення нервового збудження, побудова опорного молекулярного матриксу аксонів та забезпечення процесів їх трофічного росту, а також підтримка сталості систем міжклітинної комунікації [1]. Різні патологічні стани нервової системи або усього організму в цілому можуть суттєво порушувати структуру мієлінової оболонки.

Мета дипломної роботи магістра – вивчити стан мієлінової оболонки у головному мозку ссавців на початкових етапах постнатального розвитку; оцінити біохімічну відповідь олігодендроглії до ішемічного стану мозку. Об'єктом дослідження був головний мозок щурів. Предмет дослідження: стан мієлінової оболонки головного мозку гризунів.

Згідно з поданою метою поставлено такі завдання: проаналізувати літературні дані, в яких розглядається біохімічна відповідь олігодендроцитів за умов ішемічного ушкодження мозку гризунів; визначити кількісні показники основного білка мієліну та загального протеїну у різних відділах головного мозку щурів на ранніх етапах постнатального розвитку; оцінити рівень загального протеїну та основного білка мієліну за ішемічного стану мозку гризунів та при введенні терапевтичних препаратів – Корвітину та альфа-кетоглутарату.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Структура та функції мієліну

Мієлінізація нервових волокон ЦНС – динамічний процес, в основі якого лежить багаторівнева координація проліферації і диференціації клітин-попередників (OPCs) в зрілі олігодендроцити. Ці процеси необхідні для побудови мієлінових оболонок навколо аксонів нейронів, що, в свою чергу, служить умовою для забезпечення швидкої стрибкоподібної нервової провідності. Розкриття механізмів і молекулярних посередників мієлінізації служить важливою ланкою для розуміння біології нейро-гліальних взаємодій і має важливе практичне значення при лікуванні демієлінізуючих розладів ЦНС [2].

Рентгеноструктурний аналіз та електронна мікроскопія внесли свій внесок у вивчення структури мієлінових оболонок (мієліну). Виняткова властивість цих мембран полягає в тому, що їх формування здійснюється шляхом спірального обвиття відростків олігодендроглії в ЦНС і шванноцитів у ПНС навколо аксонів нервових клітин. За даними електронної мікроскопії у структурі мієліну виділяють суцільні концентрично розташовані темні лінії, відокремлені одна від одної світлими проміжками. Подвійна мембрана клітини декілька разів спірально закручується навколо аксона. Темні лінії утворюються при злитті внутрішніх листків клітинної мембрани, а світлі – зовнішніх. Внутрішні листки складаються з ліпідів, а зовнішні – з білків.

Ліпіди мієліну представлені фосфоліпідами, гліколіпідами і холестеролом. Вони побудовані за єдиним планом, мають гідрофобний компонент («хвіст») і гідрофільну групу («голівку»). На частку холестеролу відводиться близько 28%, 43% – на фосфоліпіди і 29% становлять гліколіпіди (галактоліпіди).

За допомогою рентгеноструктурного аналізу тканин головного мозку щурів досліджено білкові компоненти мієліну (29 білків). Докладно вичені основний білок мієліну (myelin basic protein або MBP), протеоліпідний білок, мієлін-асоційований глікопротеїн (рис. 1. 1), конексин 32 та периферичний мієліновий білок [3].

Рис. 1. 1. Білки мієліну: MAG – мієлін-асоційований глікопротеїн; MOG – мієлін-олігодендроцитарний глікопротеїн; PLP – протеоліпідний білок (ліпофілін); MBP – основний білок мієліну (ОБМ) [3]

Процеси утворення мієлінової оболонки у центральній та периферичній нервовій системі мають певні відмінності. При формуванні мієліну ЦНС один олігодендрогліоцит має зв'язки з декількома сегментами мієліну кількох аксонів; при цьому до аксона приєднується відросток олігодендрогліоциту, розташованого на деякій відстані від аксона, а зовнішня поверхня мієліну контактує з позаклітинним простором. Шванівська клітина при утворенні мієліну ПНС формує спіральні пластинки мієліну та відповідає лише за окрему ділянку оболонки між перехватами Ранв'є. Цитоплазма шванівської клітини витискується з простору між спіральними витками і залишається тільки на внутрішній та зовнішній поверхнях мієлінової оболонки

Мієлінові оболонки нервових клітин ЦНС і ПНС мають високий вміст специфічного маркерного протеїну – основного білка мієліну (далі – ОБМ) [4]. Показано, що нервові волокна, у складі яких виявлено цей протеїн, можуть максимально ефективно проводити нервове збудження. Тому ОБМ – це важливий структурний білок, який бере участь у синтезі мієліну і грає важливу роль в ЦНС [5, 6].

Транскрипційні продукти гена ОБМ в людини, миші та щура відрізняються. Виділяють, принаймні, 5 видів транскриптів, у тому числі білки з молекулярними масами 21,5 кДа, 18,5 кДа, 17а, 17b і 14 кДа в мозку миші. Тим не менш, є тільки 4 види продуктів, що складаються з 21,5 кДа, 20,2 кДа, 18,5 кДа і 17,3 кДа-ізоформ ОБМ в людському мозку, з яких 18,5 кДа ОБМ є основним протеїном зрілого мозку [7, 8]. Ген ОБМ людини розташований на 18-й хромосомі і має у своєму складі 3 промоторні області для ініціації зчитування інформації [3].

ОБМ щура представлений чотирма изоформами з молекулярними масами 21,5, 18,5, 17,0 і 14,0 кДа відповідно. Якщо говорити про перші дві ізоформи білка, то їх кодують екзони, комплементарні людським за нуклеотидними послідовностями, проте відмінні за кількістю окремих нуклеотидів. При експресії ізоформ ОБМ з молекулярними масами 17,0 і 14,0 кДа в першому випадку відбувається делеція 6-го екзону, в другому – 2 і 6-го екзонів відповідно [3].

Білковий продукт гену ОБМ – основний компонент мієлінової оболонки, вміст якого може становити до 50% сухої маси білкових компонентів мієліну [6]. Висока експресія гену ОБМ спостерігається саме в олігодендроцитах головного мозку на рівні РНК згідно з даними серійного аналізу генної експресії (SAGE) [9].

ОБМ [10] локалізований в серозній поверхні мієліну і тісно інтегрований у сфінголіпідний матрикс [10]. Такий тісний контакт важливий для стабілізації олігодендроглії ЦНС [11]. Втрата білка призводить до перешкоди мієлінізації, оскільки зниження рівня його експресії в тканинах мозку відображає тяжкість ушкодження ЦНС і мієліну [12, 13]. Експерименти на тваринах [14] довели, що в головному мозку дорослих щурів транскрибується незначна кількість ОБМ мРНК, в той час як максимум експресії білка припадає на початковий постнатальний розвиток.