Определение холестерина в биожидкостях.

Лабораторное занятие №10. Обмен липидов.

Влияние желчи на активность липазы.

Скорость действия липазы в отдельных порциях жира молока можно узнать по количеству жирных кислот, образующихся при гидролизе жира за определенный промежуток времени. Количество жирных кислот определяют титрованием щелочью в присутствии фенолфталеина. В случае добавления в пробу желчи липаза активизируется, и гидролиз жиров молока протекает с большей скоростью. Результаты определения выражают в мл титрованного раствора щелочи, строят график, где на оси ординат откладывают количество 0,05 н р-ра NaOH, потраченного на нейтрализацию жирных кислот (мл), а на оси абсцисс – время (мин).

ХОД РАБОТЫ

В два стакана согласно приведенной ниже таблицей 1 создать смесь реактивов для дальнейшей инкубации, титрование проводить в конических колбах на 100 мл.

Таблица 1

Определение холестерина в биожидкостях.

Реактивы:

1. Калибровочный раствор холестерола - 4,65 ммоль/л

2. Рабочий раствор – смесь лиофильно высушенных Е и реагентов в 0,01 м растворе фосфатного буфера.

Принцип метода (см. схему на рис. 1):

Рис. 1. Схема последовательности ферментных реакций метода

Ход работы: 1. В соответствии с таблицей разлить в 2 пробирки:

* - В связи с необходимостью экономии калибровочного раствора холестерола, пробу 2 (калибратор) на группу студентов, выполняет лишь одна рабочая пара.

2. Содержимое пробирок тщательно перемешать и выдержать 10 мин в термостате при 37 С.

3. Против рабочего раствора, в кювете толщиной 10 мм со вкладышем, фотометрировать при λ 490 нм – зеленом светофильтре абсорбцию опытной и калибровочной проб.

Расчет концентрации холестерола в пробе вести по формуле:

С – концентрация холестерола;

Ао – абсорбция исследуемой пробы;

Ак – абсорбция калибровочной пробы.

Нормальная концентрация холестерола в сыворотке крови – не более 5,2 ммоль/л.

3. Определение содержание триглицеридов в биожидкостях.

Метод ферментативный колориметрический тест для определения концентрации триглицеридов с АЛФ (антилипидным фактором). Концентрация триглицеридов определяется после ферментативного гидролиза под действием липазы. Образующаяся в результате ряда ферментативных реакций перекись водорода под действием пероксидазы реагирует с 4-аминоантипирином и 4-хлорфенолом с образованием окрашенного хинонимина.

СХЕМА РЕАКЦИИ Липаза Триглицериды → Глицерол + жирные кислоты ГК Глицерол + АТФ → Глицерол-3-фосфат + АДФ ГФО Глицерол-3-фосфат + O2 → Дигидроксиацетонфосфат + H2O2

H2O2 + 4-аминоантипирин + 4-хлорофенол → хинонимин + HCl + H2O

Исследуемые образцы: Сыворотка, гепаринизированная плазма или плазма, обработанная ЭДТА.

ПРИМЕЧАНИЕ: Липемические пробы обычно вызывают мутность в реакционной смеси, что ведет к ложно- завышенным результатам. При использовании данного набора это явление устраняется благодаря исполь- зованию входящего в набор антилипидного фактора (АЛФ). Этот фактор полностью устраняет мутность, вызванную липемическими сыворотками. УСЛОВИЯ ИЗМЕРЕНИЯ Длина волны: 500 – 540 нм. Оптический путь: 1 см. Температура: 20...25°С или 37°С

Измерение: против холостой пробы по реагенту. Нужна одна холостая проба на серию

СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В трех пробирках смешать реагенты из тест-набора согласно ниже приведенной таблице 2.

Таблица 2

Содержимое пробирок перемешать, инкубировать 10 минут при 20...25°С или в течение 5 минут при температуре 37°C. Измерить оптическую плотность (А) проб и стандарта против холостой пробы. Окраска стабильна в течение 60 минут.

Расчет концентрации триглицеридов в сыворотке крови по формуле:

[ммоль/л] ,

где С – концентрация триглицеридов, моль/л;

А пробы – оптическая плотность пробы;

А стандарт – оптическая плотность пробы;

2,28 – концентрация стандартного раствора (может быть другой, написана на флаконе)

Линейность метода: Тест линеен до концентрации триглицеридов до 1000 мг/дл или 11,40 ммоль/л. Если содержание триглицеридов в пробе выше 11,4 ммоль/л, разбавьте пробу физиологическим раствором в отношении 1:4 и повторите исследование. Полученный результат умножьте на 5 (коэффициент разведения).

Клиническая интерпретация (риск атеросклероза): Слабо повышенный уровень от 1,71 до 2,28 ммоль/л (150-200 мг/дл). Существенно повышенный уровень более 2,28 ммоль/л (200 мг/дл).

ПРИМЕЧАНИЯ:

1. Для коррекции результата на присутствие свободного глицерола, вычтите из полученного значения 10 мг/дл или 0,11 ммоль/л.

2. На результат теста не влияет присутствие гемоглобина в концентрациях до 1,5 г/л или билирубина в кон- центрациях до 684 мкмоль/л. Аскорбиновая кислота при содержании выше 4 мг/дл влияет на результат.

3. Реагенты содержат азид натрия в качестве консерванта. Избегать попадания на кожу и слизистые оболочки. Не глотать

Контрольные вопросы

1.Гдевстречаютсявещества классалипидов и зачем их применяют?

2. Чем объяснить сложности классификации липидов?

3. Чем и как извлекают липиды из тканей и др. объектов?

4. Какие методы применяют для разделения липидных смесей?

5. В чем Вы видите преимуществабиофизического подхода к липидам?

6. Повозможности,сформулируйтесамое точное определение веществ, класса липидов.

7. Сгруппируйте липидные ассоциаты по их структуре и свойствам.

8. Что Вы знаете о химической классификации и функциях липидов?

9. Что вы знаете о структуре, свойствах и функциях высших жирных кислот.

10. Объясните понятия «иодное число» и «кислотное число» и области их применения.

11. Объясните происхождение и биологическую роль веществ подкласса эйкозаноидов.

12. Объясните происхождение и биологическую роль веществ подкласса изопреноидов.

13. Что Вы знаете о стеролах и их функциях в организме животных.

14. Какие производные холестерола встречаются у животных и в чем заключаются их функции?

15. Как обнаружить стеролы в биообъектах?

16. Нужны ли новорожденным млекопитающим желчные кислоты, если жир молока уже эмульгирован, а секреция липазы происходит в желудке?

17. Исходя из формул объема сферы – 4/3 πR³ и площади ее поверхности – 4 πR², рассчитайте, насколько снижается объем и возрастает площадь контакта липидных капель с липазой, при том, что диаметр капель пищевого жира ~5 мм, а их эмульгирование желчными кислотами в просвете тонкого кишечника, доводит его до 0,5 мкм.

18. Что Вы знаете о сходстве и различиях в структуре, свойствах и функциях, подкласса молекул глицеролипидов?

19. Что такое сфинголипиды и какую биологическую роль они играют?

20. Расскажите о структуре, свойствах и биологической роли восков.

21. Что Вам известно о структуре, свойствах и функциях липидных ассоциатов?