Количественное определение ортофосфата

Лабораторное занятие №8. Введение в обмен веществ и энергии.

Брожение – это способ получения энергии многими микроорганизмами (дрожжевые грибы, плесневые грибы, бактерии), протекающий в анаэробных условиях и сопровождающийся синтезом макроэргических соединений. Процессы брожения применяют для получения хлеба, кисломолочных продуктов и других традиционных биотехнологий так давно, что переоценить их роль в развитии цивилизаций - невозможно. В середине XIX в., выполняя заказ виноделов, Луи Пастер нашел, что клетки дрожжей сбраживают сахар в этиловый спирт и СО₂. Попутно он выявил и т.н. «эффект Пастера», то есть способность кислорода замедлять брожение. В 1897 г. Э. Бухнер доказал, что спиртовое брожение возможно и с помощью водного экстракта дрожжевых клеток. Затем обнаружили, что оно зависит от неорганического ортофосфата = Фн, исчезающего из среды по мере расхода глюкозы. Изолируя Е брожения, попутно идентифицировали гексозо- и триозофосфаты и, адениловые нуклеотиды.

Брожение как модель изучения процессов метаболизма.

Cпиртовое брожение – простая и удобная модель для освоения основных приемов изучения метаболизма. Мерой его активности служит динамика изменений концентрации Фн в среде брожения за определенные отрезки времени.

Подготовка, инкубация и контроль системы брожения

1. Студенты-добровольцы или дежурные, по указанию лаборанта занимают рабочее место с необходимой посудой, растворами и готовыми навесками дрожжей и глюкозы по 1,5 г.

2. Один из студентов маркирует 4 центрифужных пробирки и, разлив в них по 1 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты = ТXУ, помещает пробирки в ледяную баню.

3. Параллельно, другой студент смешивает в фарфоровой ступке навески дрожжей и глюкозы и, по возможности, растирает их пестиком, постепенно добавляя к смеси 20 мл дистиллята, порциями по 2-5 мл.

4. Количественно перенести смесь в коническую колбу на 100 мл, омыв ступку и пестик 10 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,4.

5. Перемешав содержимое колбы, тут же отобрать из нее для контроля 1 мл взвеси и, для осаждения белков, перенести его в стоящую во льду пробирку № 1.

6. Поместить колбу с системой брожения в термостат при 37 С и установить таймер на 15 мин.

7. Каждые 15 мин по звонку таймера, дежурные отбирают из колбы пробы по 1мл, соответственно помещая их в стоящие на льду пробирки № 2, 3 и 4.

8. Соответственно пробиркам, пронумеровать 4 мерных колбы на 25 мл для последующих разведений центрифугата.

9. По окончании инкубации, с термостатом, системой брожения и оборудованием рабочего места поступить по указанию лаборанта.

10. Через 10 мин после осаждения белков в пробе 4, пробирки извлечь из ледяной бани, попарно уравновесить их на центрифужных весах, после чего разместить по диаметру ротора центрифуги.

11. Закрыть центрифугу крышкой и, соблюдая правила работы с нею, включить центрифугу при 2000 об/мин на 10 мин.

12. Учитывая высокую чувствительность фосфомолибдатного метода анализа и пределы его калибровочного графика, развести надосадки в 50 раз. Для этого:

13. Меняя наконечники полуавтоматического дозатора на 500 мкл, перенести по 0,5 мл каждого надосадка в соответственно пронумерованные мерные колбы.

14. Довести водой до меток объемы их содержимого.

Количественное определение ортофосфата

методом Лоури-Лопеца

Принцип метода: Основан на образовании фосфомолибдатного комплекса (Н₇[Р(Мо₂О₇)₆] х nН₂О), который восстанавливают гидрохиноном и др. до молибденовой сини, колориметрируя затем интенсивность окраски. Белки, мешающие определению Фн, предварительно удаляют из проб общепринятыми способами. Один из самых простых и чувствительных (35-50 нмоль Фн на пробу) – метод Лоури-Лопеца, где восстановитель – аскорбиновая кислота.

Ход работы: 1. За время инкубации системы брожения, каждая рабочая пара студентов маркирует 10 пробирок: 6 – для построения калибровочных проб и еще 4 – для разведенных центрифугатов.

2. В соответствии с таблицей 1, в пробирки 1-6 внести указанные объемы основного 10^{-4 М раствора} Na₂HPO₄ х 2H₂O и дистиллята.

Таблица 1

Калибровка растворов для определения неорганического фосфата = Фн

3. Получив у дежурных мерные колбы 1 – 4 с разведенными центрифугатами исследуемых проб, отобрать из каждой по 2,7 мл раствора и, соответственно перенести их в пробирки 7 – 10.

4. Получить у лаборанта свежеприготовленные 1 % растворы:

а) молибдата аммония (NH₄)Mo₇O₂₄ х 4Н₂О в 6 н серной кислоте; б) аскорбиновой кислоты в 0,0005 н растворе сульфата меди (CuSO₄ х 5H₂O).

5. Во все 10 рабочих пробирок добавить по 0,4 мл 1 % раствора молибдата аммония.

6. Точно через 5 мин, также во все пробирки добавить по 0,4 мл 1% раствора аскорбата и, тщательно перемешав пробы, оставить их точно на 20 мин на столе для развития окраски.

7. Фотометрировать все 10 проб против воды, в кюветах на 5 мм и красном светофильтре, занося соответственно, результаты калибровки в таблицу 1, а исследуемых проб – в таблицу 2 протокола занятия.

9. На основании данных таблицы 2 построить калибровочный график зависимости А = абсорбции раствора от концентрации Фн в пробах.

10. С помощью калибровочного графика и, с учетом разведения проб в 50 раз, рассчитать и внести в таблицу 2 концентрации Фн в инкубационной среде.

Таблица 2

Динамика убыли ортофосфата в инкубационной среде

в процессе брожения

11. По результатам опыта, построить график динамики убыли фосфата в процессе брожения и сделать выводы.