Питательные среды, их состав, и приготовление.

Кафедра ботаники, генетики, физиологии растений и биотехнологий

УДК 635.9:582.711.712:581.6

Курсовая работа

по дисциплине «Сельскохозяйственная биотехнология» на тему:

Оздоровление и микроклональное размножение роз

Выполнил студент группы Аб-31б

направлению110400.62 «Агрономия»

Меркушев Сергей Антонович

Руководитель-канд. с/х. наук,

доцент Смолин А.М.

Пермь 2015

Содержание

Введение 3

Раздел 1 Технология и техника микроклонального размножения растений 4

1.1 Оборудование биотехнологической лаборатории 4

1.2 Питательные среды, их состав и приготовление 5

1.3 Подготовка растительного материала, стерилизация эксплантов, термотерапия и химиотерапия 9

1.4 Условия культивирования регенерантов 13

Раздел 2. Клональное микроразмножение и оздоровление роз 14

2.1 Технология оздоровления от вирусных инфекций 14

2.2 Экспланты, режим стерилизации 15

2.3 Способы размножения in vitro 16

2.4 Адаптация микрорастений к внешним условиям in vivo, приемы повышения урожайности 17

Выводы 18

Библиографический список 19

Введение

Микроклональное размножение растений — один из способов вегетативного размножения в условиях in vitro. Клональным микроразмножением называют неполовое размножение растений с помощью метода культуры тканей, позволяющее получать растения, идентичные исходному.

Микроразмножение является весьма эффективным приемом быстрого распространения и оздоровления от инфекции новых сортов и гибридов картофеля, плодовых, ягодных, декоративных и лесных растений. Методы микроразмножения широко используются селекционерами для ускоренной репродукции ценного материала. Размножение растений in vitro может стать важным инструментом поддержания существующего биоразнообразия редких и исчезающих видов.

Целью данной курсовой работы является посмотреть и изучить процесс микроклонального размножения и оздоровления Rosa L. рассмотреть приборы и оборудование, технологии выращивания и оздоровления, сделать выводы о проделанной работе.

При написании курсовой работы необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить теорию и технологии микроклонального размножения, приборы и оборудование, питательные среды их состав и приготовление, подготовка исходного растительного материала условия культивирования.

2. Рассмотреть клональное микроразмножение и оздоровление технологи экспланты, способы и адаптацию к внешним условиям роз.

Технология и техника микроклонального размножения растений

Оборудование биотехнологической лаборатории

Для организации биотехнологической лаборатории необходимы просторные изолированные помещения, а также современное оборудование и высококачественные реактивы. Для удобства проведения дезинфекции полы стены и потолок в помещениях должны иметь водостойкое и ультрофиолетоустойчивое покрытие.

Оборудование моечного помещения: должны быть глубокие раковины из кислотостойкого материала и краны с горячей и холодной водой, дистиллированная вода; дистилляторы и бидистилляторы; сушильные шкафы с режимом работы для сушки посуды до 100-130 ⁰С, для инструментов до 170 ⁰С, шкафы для хранения чистой посуды и инструментов, емкости для хранения моющих средств, вытяжные шкафы с эксикаторами для хромпика (H₂SO₄ 98 % + K₂CrO₇).

Оборудование помещения для приготовления питательных сред: лабораторные столы, холодильники для хранения маточных растворов солей, гормонов и витаминов, аналитические и торсионные весы; иономер, магнитные мешалки, плитки, газовые горелки, набор посуды (колбы, стаканы, мерные цилиндры, мензурки, пробирки и др.), необходимый набор химических реактивов надлежащей степени чистоты (ХЧ, Ч, ЧДА).

Оборудование помещения для стерилизации: автоклавы с режимом работы – давление 1-2 атмосферы и температура 120 ⁰С, стеллажи для штативов с питательными средами, шкафы для хранения стерильных материалов. Данное помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и иметь канализационный слив для отвода конденсата из автоклава.

Оборудование помещения для инокуляции растительных эксплантов на питательные среды: ламинарный бокс, в который нагнетается стерильный воздух, проходящий через бактериальные фильтры. Ламинарий размещают в отдельной комнате. Если нет ламинарных боксов, то оборудуют специальную комнату-бокс - операционную. Стены такой комнаты облицовывают кафелем, пол застилают линолеумом. Двери операционной должны герметично закрываться и перед ними должен быть тамбур (передбоксник). В бокс должно поступать стерильный кондиционированный воздух. Бокс оснащают бактерицидными лампами. Нужны лабораторные столы, стеллажи, шкафы для материалов и оборудования.

Оборудование культуральных помещений: световое отделение – источники освещения со спектром близким к спектру дневного света (от 3 до 10 kLx), кондиционер для регуляции температуры (25± 2 ⁰С) и влажности воздуха (70 %), стеллажи для штативов с культивируемым материалом; темновое отделение с тем же оборудованием, исключая источники освещения. Для культивирования эксплантов на питательной среде желательно использовать термостаты или хладотермостаты, способные с высокой точностью поддерживать задаваемые режимы температуры и влажности воздуха.

Необходимый набор посуды, инструментов и материалов в биотехнологической лаборатории: мерные колбы, колбы Эрленмейера, химические стаканы, мерные цилиндры, чашки Петри, пробирки, бутылки, пипетки, стеклянные палочки, стеклянные и мембранные фильтры, ланцеты (в том числе глазные, хирургические, анатомические), ножницы, пинцеты, ножи, бритвенные лезвия, препарировальные иглы, шпатели, бумага (оберточная, пергаментная, фильтровальная), фольга алюминиевая, вата, марля, шпагат (Бирюков В.С., 2004).

Питательные среды, их состав, и приготовление.

В культуре in vitro применяют жидкие и агаризованные (плотные) среды. Жидкие среды используют для культивирования суспензий, каллусов, изолированных органов и тканей, растений-регенерантов. При этом для поддержания эксплантов в пробирки со средой помещают специальные мостики-поддержки из фильтровальной бумаги или синтетических пористых материалов.

В зависимости от вида растений необходимо использовать как плотные (агаризованные), так и жидкие питательные среды. Иногда жидкие среды имеют преимущество, так как обеспечивают большую подвижность трофических элементов. Например, при размножении роз более успешным было культивирование побегов на двухслойной питательной среде: нижний слой агаризованный, верхний жидкий.

На эффективность размножения могут также влиять расположение экспланта (горизонтальное или вертикальное), тип пробок (ватные, пластмассовые, стеклянные, металлические и т. д.), а также соотношение объема эксплантов и количества питательной среды для оптимального освещения и газообмена эксплантов. Состав питательной среды необходимо подбирать для каждого вида растений. На микроклональное размножение влияют гормоны, минеральные соли, витамины и углеводы. При размножении in vitro часто используют среды Мурасига и Скуга, Гамборга, Хеллера и другие. Обычно используют среду Мурасига и Скуга (MS), которая содержит много неорганического азота, что стимулирует процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза. Вопрос оптимального соотношения NH₄ NO₃ остается открытым, так как литературные данные весьма противоречивы и универсального рецепта для всех видов растений нет.

В качестве источника углеродного питания используют различные углеводы типа сахарозы, глюкозы, фруктозы, галактозы. Разные культуры требуют различной концентрации углеводов на разных этапах микроклонального размножения. Компоненты среды для выращивания растительных клеток и тканей можно разделить на 6 основных групп, что обычно отражает порядок приготовления концентрированных маточных растворов: макроэлементы, микроэлементы, источники железа, витамины, источники углерода, фитогормоны. Основой для всех питательных сред для культивирования растительных эксплантов является смесь минеральных солей. Это соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора – в виде фосфатов; серы – в виде сульфатов; а также растворимых солей К⁺, Na⁺, Са⁺⁺, Мg⁺⁺. Железо используется в виде хелатов [Fe₂SО₄ или Fe₂SO₄ + ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или её натриевая соль Na ЭДТА (трилон Б)] наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями.

Азот, фосфор, сера входят в состав органических соединений: белков, жиров, нуклеиновых кислот. Железо, цинк, марганец, молибден, кобальт в сочетании с порфиринами образуют макромолекулы пигментов фотосинтеза (хлорофилла), окислительно-восстановительных ферментов (каталазы, пероксидазы, полифенолоксидазы). Следовательно, все эти соединения выполняют в клетках и тканях структурную функцию. В то же время ионы К⁺, Na⁺, Са⁺⁺, Cl^–, Н⁺ необходимы для регуляции pH среды и поддержания физиологических градиентов клеток (тургора, осмотического давления, полярности).

В качестве источника углерода для биологических макромолекул, а также при культивировании гетеротрофных тканей (каллусов и суспензий) в питательные среды добавляют углеводы в концентрации 20-60 г/л. Обычно это дисахариды (сахароза), моносахариды (гексозы: глюкоза и фруктоза, пентозы: ксилоза и другие). Полисахариды в питательных средах практически не используются. Только некоторые типы тканей (опухолевые), содержащие гидролитические ферменты, выращивают на средах с крахмалом, рафинозой, целлобиозой.

Для стимуляции биохимических реакций в клетке используют биологические катализаторы – витамины группы В (В1, В6, В12), С (аскорбиновую кислоту), РР (никотиновую кислоту), мезоинозит.

Для управления процессами формообразования в культуре тканей необходимы биологические регуляторы роста и развития – фитогормоны. Эти вещества влияют на дифференциацию и дедифференциацию клеток и тканей, инициируют гистогенез, индуцируют деление и растяжение клеток, участвуют в процессах старения и созревания, либо стимулируют, либо ингибируют рост и развитие клеточных культур, обуславливают формирование пола. В биотехнологических исследованиях чаще используют гормоны, стимулирующие рост и развитие: ауксины, цитокинины, гиббереллины (Егорова Т.А. 2003).

Порядок приготовления питательной среды

1. Взять навеску агар-агара 8 грамм поместить в стакан на 800 мл, смочить холодной водой, перемешать, налить 300мл горячей воды и поставить в кипящую водяную баню для растворения.

2. Включить магнитную мешалку без нагрева, в литровую колбу поместить магнит, налить 300 мл дистиллированной воды и поставить на мешалку, отрегулировать обороты так, чтобы не было брызг среды.

3. И начать приливать в колбу:

- макросоли 50 мл взять мерным цилиндром.

- CaCl 10 мл, стеклянной пипеткой Мора.

- микросоли 1 мл или 1000 мкл, взять микропипеткой.

- хелат железа 5 мл, взять стеклянной пипеткой Мора.

Витамины:

- Тиамин или B1 – 50 мкл, взять микропипеткой.

- Пиридоксин или B6 – 50мкл, взять микропипеткой.

- PP или никотиновая кислота 100 мкл, взять микропипеткой.

- C или аскорбиновая кислота 100 мкл, взять микропипеткой.

- Пантотеновая кислота пол таблетки в размолотом состоянии.

- Глицин 2 мг или 2-3 кристалла.

- Гормоны 2,4 Д 3 или 6 мг или 6 БАП.

- Глюкоза 20 г/л.

- Отрегулировать pH до 5,8 добавив 12 капель 0.1 NaOH.

4. Включить нагрев мешалки и добавить в колбу горячей воды до объема 600 мл.

5. Полностью расплавленный агар-агар вылить в колбу, маленькими порциями горячей воды стеклянной палочкой смыть остатки агар-агара до 1 литра.

6. Готовую питательную среду разлить в колбы, около 25мл, закрыть их фольгой.

7. Поместить колбы в автоклав и проавтоклавировать.

8. Чашки Петри, колбы с питательной средой, вату, марлю, фильтровальную бумагу, колбы с дистиллированной водой (закрытые фольгой) поместить в автоклав.

9. Автоклав привести в рабочее состояние: закрыть плотно крышку, воду залить до метки. Включить автоклав, давление пара довести до метки 1,2 атм. (в паровой камере), заполнить паром стерилизационную камеру, вытеснить конденсат в течение 10 минут, при этом давление пара в стерилизационной камере должно быть на уровне 0,1-0,2 атм. Довести давление в стерилизационной камере до 1 атм., включить автоматический режим.

10. Автоклавировать 20 минут при давлении в стерилизационной камере 1-1,2 атм.

11. Отключить автоклав, вытеснить пар из обеих камер довести давление до 0 атм.

12. Проавтоклавированные материалы перенести в комнату для пересадки тканей и поместить в шкафы или на стеллажи (Смолин А.М.,2011).

1.3 Подготовка растительного материала, стерилизация эксплантов, термотерапия и химиотерапия

С целью получения эксплантов для каллусной и опухолевой культур, микроклонального размножения, изучения гормональной регуляции используют стерильные проростки. Семена для проращивания высевают либо на воду, либо на питательную среду.

Растительные объекты перед стерилизацией тщательно отмывают проточной водой, иногда с моющими средствами, очищают от излишних тканей. С корнеплодов и корней снимают кожуру, с побегов – кору, с почек – кроющие чешуи.

Растительные экспланты стерилизуют растворами веществ, содержащими активный хлор (хлорамином, гипохлоритом Nа), бром (бромной водой), tween-20, перекисью водорода, спиртом, нитратом серебра, диацидом, антибиотиками. Следует подбирать такие концентрации стерилизующих агентов, которые не повреждали бы сами семена, не угнетали их всхожесть и обеспечивали максимальную стерильность.

Этиловый спирт часто применяют для предварительной стерилизации, протирая им поверхность материала или погружая материал на несколько секунд в абсолютный спирт. Иногда такой стерилизации достаточно, ее используют при работе с плодами, семенами, побегами, завязями.

Гипохлорит кальция (хлорная известь) используется в виде 5-7 % раствора для обработки почек, завязей, цветков, семян, побегов в течение 5-8 минут.

Гипохлорит натрия используется в виде 0,5-5 % раствора для обработки любых эксплантов в течение 1-20 минут. Это вещество является клеточным ядом, поэтому время стерилизации и концентрацию подбирают экспериментально. Например: для изолированных зародышей используют 2-3 % раствор в течение 10-15 минут, а для сухих семян 3-5 % раствор в течение 1 часа. Остатки гипохлорита натрия сначала удаляют 0,01 н HCl, а затем 8 раз промывают автоклавированной дистиллированной водой.

Хлорамин применяют в концентрации 1-6 %. Пыльники и молодые зародыши обрабатывают в течение 1-3 минут, сухие семена – 30-60 минут, затем промывают стерильной дистиллированной водой 2-3 раза.

Сулема – токсичное вещество и требует особой тщательности, как при хранении, так и при подборе концентрации для отдельных объектов. Для стерилизации зародышей используют 0,1 % раствор в течение 1-3 минут, для корней и клубнеплодов – до 10-20 минут.

Растворы, содержащие активный хлор используются 1 раз и готовят их непосредственно перед работой.

Диацид используется в 0,2 % растворе для стерилизации корнеплодов, семян, кусочков, тканей, верхушечных меристем, изолированных зародышей, пыльников. Диацид готовят, растворяя отдельно 330 мг этанолмеркурхлорида и 660 мг цетилпиридиния хлорида в горячей воде (330 мл), затем их смешивают и доводят объем жидкости до 1 л, добавляют несколько капель детергента твин-80; хранят в плотно закрытой колбе в темноте.

Антибиотики применяют для стерилизации растительного материала, инфицированного бактериями (ткани корончатогалловых опухолей). Наиболее часто применяют стрептомицин и тетрамицин 10-80 мг/л, ампициллин 200-400 мг/л, левомицитин, канамицин и другие.

В качестве стерилизующего агента применяют также перекись водорода, которая менее всего повреждает экспланты и после которой не требуется отмывка в стерильной воде, так как она быстро разлагается.

Стерилизацию эксплантов необходимо проводить в стерильных (асептических) условиях: в ламинарном боксе.

Колбы с эксплантами после помещаются в абсолютную темноту при комнатной температуре на неделю для выявления степени стерильности. Те колбы, в которых началось заражение, следует сразу удалять (Шевелуха В.С., 1998).

Снизить риск попадания вирусов в здоровые ткани можно путем применения предварительной термотерапии или химиотерапии исходных растений. Метод термотерапии применяется как в условиях in vivo, так и in vitro и предусматривает использование горячего сухого воздуха. Для объяснения механизма освобождения растений от вирусов в процессе термотерапии существуют различные гипотезы. Согласно одной из них при высоких температурах разрушаются белковая оболочка и нуклеиновая кислота вируса. Вторая гипотеза предполагает действие высоких температур на вирусы через метаболизм растений. При такой температуре начинает преобладать деградация вирусных частиц, а синтез их, наоборот, уменьшается. Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в термокамеры, где температура в течение первой недели повышается с 25 до 37 ^оС путем ежедневного увеличения температуры на 2 градуса. Все остальные режимы обязательно поддерживаются в оптимальном состоянии: освещенность, высокая относительная влажность воздуха, определенный фотопериод. Продолжительность термостатирования зависит от состава вирусов и их термостойкости. Если для гвоздики достаточно 10 - 12 недельного воздействия теплом, то для хризантемы этот период превышает 12 недель.

Помимо положительного действия высоких температур на освобождение от вирусов, выявлено аналогичное влияние их на точку роста и процессы морфогенеза некоторых цветочных культур (гвоздики, фрезии) в условиях in vitro. Высокие температуры увеличивают коэффициент размножения на 50 - 60%, повышают адаптацию пробирочных растений к почвенным условиям и позволяют получить больше безвирусных маточных растений.

Другой способ оздоровления - химиотерапия. В питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, добавляют препарат вирозола в концентрации 20 - 50 мг/л, не больше. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. Применение его позволяет увеличить число безвирусных растений с 40% до 80 - 100%.

Метод предполагает использование химических соединений - ингибиторов вирусов, которые добавляются в состав питательной среды. Наиболее часто для этих целей применяют 1 β- Д- рибофуранозил –1,2,4 – триазол – 3 карбоксимид ( коммерческое название виразол). Виразол стерилизуется путем фильтрации и добавляется в охлажденную среду. Концентрации препарата зависят от вида растений (1- 100 мг/л), длительность обработки подбирается эмпирически. По мере возрастания концентрации усиливается процесс элиминации вирусов, однако при концентрации выше 20-50 мг/ л уменьшается темп роста и может наблюдаться фитотоксический эффект. Виразол показал высокую эффективность при оздоровлении картофеля, черешни, сливы, малины, декоративных растений.

В Белорусском НИИ картофелеводства успешно испытан метод оздоровления посадочного материала картофеля на основе применения 2–5- олигоаденилатов – соединений, относящихся к классу олигонуклеотидов и являющихся посредниками противовирусного действия интерферона. Для 2-5– олигоаденилатов обнаружен большой спектр биологической активности, включая противовирусную, фитостимулирующую, цитокинино подобную и др (Калашникова Е.А. 2001).