Условия культивирования регенерантов. При выращивании культур клеток необходимо соблюдать внешние условия культивирования регенерантов при выращивании растений из черенков. Их сажают в пробирки с питательной средой, помещают в световую комнату и выращивают в благоприятных условиях, при температуре 25-28 ºC, при 16 часовом фотопериоде, влажности воздуха 60-70% освещенности 2-5 тыс. лк (Кузьмина H.A. 2000).
Клональное микроразмножение и оздоровление роз
Технология оздоровления от вирусных инфекций.
Метод основан на способности растения к регенерации отсутствующих органов. Из отдельных частей почки возникает целое растение со всеми характерными свойствами данного вида и материнского растения. Таким образом, характерные черты любого сорта розы клонированием можно сохранять длительное время.
У растений, размножаемых вегетативно, в сравнении с семенным потомством, есть свои преимущества:
– по индивидуальному развитию они на порядок выше, поэтому быстрее зацветают;
– однородны как генетически и анатомически, так и функционально-физиологически;
– можно закрепить спонтанные мутации;
– способны на самовозобновление после потери надземных вегетативных органов, более выносливы, продуктивны и долговечны;
– применяя современные методы вегетативного размножения (культуру тканей), можно спасти растения от самых опасных заболеваний, например от вирусных.
Процесс микроклонального размножения растений in vitro требует прохождения следующих этапов:
1) инициация культуры, или введение меристемной ткани растения на подходящую питательную среду;
2) пролиферация, или наращивание микростеблей;
3) укоренение микростеблей;
4) акклиматизация и высадка в полевые условия in vivo Причина преимущества применения безвирусного посадочного материала, полученного in vitro, кроется в том, что растения, проходя путь от меристемастических клеток до взрослых растений, проходят процесс «реювенилизации» (омолаживания), в результате чего лишаются действия накопившейся в растениях “усталости”, вызванной стрессовыми факторами.
Для того чтобы получить высококачественный посадочный материал, свободный от вирусных, грибных и бактериальных заболеваний, применяется клональное размножение растений цветочных, плодовых и ягодных культур in vitro. У трудно размножаемых в обычных условиях видов растений при использовании данного способа размножения имеется реальная возможность производить в больших количествах вегетативное потомство (Бутенко Р.Г., 1964).
2.2 Экспланты, режим стерилизации.
Для введения в культуру ткани растений у представителей рода Rosa L. в качестве исходного экспланта берут из верхушки энергично растущего побега, около 20-40 мм длинной апикальные и латеральные почки, не одревесневших или одревесневшие побеги. Для стерилизации вводимых эксплантов применяют различные способы их обработки (Кузьмина, Потапова, 2002).
На начальном этапе почки одревесневших побегов растений розы Rosa L промывали проточной водой с добавлением моющих средств в течение 15-20 минут, затем почки очищали от кроющих чешуй и листьев. Основную стерилизацию проводили двумя способами: 10 % раствором доместоса и 5 % раствором лизоформина, промывка дистиллированной водой (3 раза). После чего стерильный материал помещали на искусственную питательную среду МС без гормонального состава. Результаты стерилизации эксплантов различными способами показали их различную эффективность. Так, в первом варианте опыта выход стерильных эксплантов не превышал 20%. Во втором варианте выход стерильных эксплантов у данного сорта составил 80 % (Акшикова Н.А., 2013).
Способы размножения in vitro.
После стерилизации почки высаживают на твердую питательную среду МС, в пробирки и помещают в световую комнату.
На этом этапе некоторые исследователи для лучшего роста микропобегов розы в культуре in vitroрекомендуют различные концентрации 6-БАП в пределах 0,5 – 1,0 мг/л (Кузьмина, Потапова, 2002).
Рост каллусной ткани первичных эксплантов проходил на среде, содержащей помимо основных добавок (сахароза, агар, мезоинозит, тиамин –HCL, пиридоксин-HCL, глицин), а также цитокинин – БАП (0,5 мг/л) и ауксин – НУК (0,15 мг/л). Через 2 недели инкубации образовался морфогенный каллус: у первичных каллусов наблюдали появление почек, одиночных или многочисленных боковых побегов. Их вырезали и переносили на среды содержащие наряду с основными добавками, БАП – 1,0 мг/л, НУК – 0,1 мг/л или БАП – 2,0 мг/л, 2,4 Д – 0,2 мг/л. На обеих средах спустя 2,5 недели отмечалось разрастание старых побегов и новых. У некоторых образцов образовались корни. Через 3,5 недели в части пробирок (около 5%) появились полноценные растения с листьями и корнями.
Микроразмножение почек проводили на среде, включающей на ряду с основными добавками также 0,1 мг/л ИМК и 1,5 мг/л БАП.
Не образовавшие корней побеги переносили на среду, содержащую 0,75 мг/л БАП и 0,05 мг/л ИМК. Через 4 недели наблюдались развитие корней практически во всех условиях.
Используемые в наших исследованиях среды отличались различным содержанием (БАП - 1,0 мг/л, НУК-0,1 мг/л или БАП - 2,0 мг/л, 2,4 Д -0,2 мг/л). В процессе наблюдений было выявлено, что питательная среда с гормональным составом в БАП - 1,0 мг/л, НУК-0,1 мг/л дает больший процент образования микроклонов за месяц, в отличии от содержания БАП - 2,0 мг/л, 2,4 Д -0,2 мг/л в питательной среде (Павловская Н.Е., 1998).
Адаптация микрорастений к внешним условиям in vivo, приемы повышения урожайности.
Когда у микроклона образовывались корни, его извлекали из стерильных условий и сажали в горшки, заполненные субстратом. Но перед высадкой в почву, регенеранты проходили акклиматизацию во влажной камере на вермикулите в течение двух недель, а затем горшочки помещали в микро теплички, чтобы дать микрорастениям возможность постепенно привыкнуть к естественным условиям. Как только они адаптировались (через 4-6 недель), поддерживали обычные условия выращивания для данного вида роз. В качестве субстрата использовали торфа-песочную смесь 1:3 и велторф. Наибольший процент приживаемости растений-регенерантов наблюдали во втором типе субстрата 90%. После адаптации к комнатным условиям, пересаживали в открытый грунт, где они прекрасно себя чувствуют, растут и цветут (Акшикова Н.А., 2013).
Выводы
В данной курсовой работе можно сделать несколько выводов.
В первой главе этой работы мы познакомились с технологиями и техникой микроклонального размножения в биотехнологии, а также познакомились с приборами и оборудованием необходимым для создания лаборатории по микроклональному размножению. Ознакомились с приготовлением питательных сред с их агрегатными состояниями и составляющими компонентами. Также ознакомились с режимами стерилизации эксплантов процессами химиотерапии, термотерапии, а также препаратами для стерилизации и сроками. Ознакомились с условиями внешними условиями культивирования регенерата.
Во второй главе мы разобрали технологию оздоровления и микроклонального размножения роз. Для начала изучили технологию оздоровления от вирусных инфекций, далее изучили экспланты для размножения и оздоровления и режим стерилизации. Потом познакомились со способами размножения in vitro. И проведением адаптации к внешним условиям среды.
На основе этих двух выводов можно сделать один общий вывод о том что полученные знания в этой научной работе можно применять на практике. Розы возможно ввести в культуру in vitro и получать оздоровлённые их сорта, для получения оздоровленного посадочного материала для цветоводства.
Библиографический список
1. Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: Учеб. пособие.– М.: ФБК-ПРЕСС, 1991. - 160с.
2. Бирюков В.С. Основы промышленной биотехнологии. М.: КолосС, 2004. - 296с.
3. Егорова Т.А. Основы биотехнологии: Учеб. пособие для высш. пед. учеб. заведений / Т. А. Егорова, С. М. Клунова, Е. А. Живухина. – М:. Издательский центр «Академия», 2003. – 208с.
4. Калашникова Е.А. Получение посадочного материала древесных, цветочных и травянистых растений с использованием методов клеточной и генной инженерии. Учебное пособие / Е.А. Калашникова, А.Р. Родин. – Москва, 2001. – 71с.
5. Клеточная инженерия Методическое пособие к лабораторно-практическим занятиям по биотехнологии. Сост. А.М. Смолин, 2011.- 52с.
6. Кузьмина H.A. Культивирование меристем различных сортов роз in vitro. Естественные науки и экология: Ежегодник / Н.А. Кузьмина. O.A. Потапова. – Омск, 2000. вып. 5. – С. 38-39.
7. Особенности технологи выращивания розы (Rose) в культуре ткани / Под ред. Н.А. Акшиковой – М.: Колос, 2013. – 3с.
8. Павловская Н.Е., Введение в сельскохозяйственную биотехнологию: Учебное пособие / Н.Е., Павловская Л.В., Голышкин, Л.В. Голышкина, - Орел: Изд-во ОГСХА, 1998. – 204с.
9. Шевелуха В.С. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб./, В.С. Шевелуха, Е. А. Калашникова, С. В. Дегтярев – М.: Высшая школа, 1998. – 416с.
|