Ферменты биосинтеза ДНК. Прокариоты.

Хеликаза – раскручивает двойную спираль ДНК в репликационной вилке.

РНК-полимераза (праймаза) катализирует синтез олигорибонуклеотида (от 10 до 60 нуклеотидов), т. е. праймера, с которого начинается синтез ДНК.

Праймасома - комплекс, включающий около 20 полипептидов. Участвует в формировании специфической вторичной структуры ДНК, подходящей для узнавания праймазой.

ДНК-полимераза I катализирует отщепление праймера, удаление ошибочно присоединенных нуклеотидных остатков и заполнение образующихся пробелов (ДНК-полимеразная активность).

ДНК-полимераза II достраиваете поврежденные участки в молекуле ДНК, т. е. осуществляет репарациюДНК.

ДНК-полимераза III катализирует синтез ведущей (лидирующей) и отстающей цепей ДНК при репликации.

ДНК-лигаза соединяет две цепи ДНК или замыкает два конца одной цепи в процессе репликации либо репарации.

Топоизомеразы создают или уничтожают суперспирализацию путем сшивания образующихся разрывов или разрезания ДНК.

ДНК-полимеразы эукариот – α, β, γ, d, ε.

В репликации ДНК участвуют два главных типа полимераз - α и d.
ДНК-полимераза d катализирует синтез ведущей цепи ДНК, а
ДНК-полимераза α - отстающей цепи ДНК, являясь составной частью праймасомы. Ни одна из ДНК-полимераз эукариот, в отличие от прокариот, не обладает нуклеазной активностью.

ДНК-полимераза γ реплицирует митохондриальную ДНК.

ДНК-полимераза ε в ряде случаев заменяет ДНК-полимеразу d.

ДНК-лигаза устраняет разрывы в одной из цепей ДНК, замыкает линейную молекулы ДНК в кольцевую структуру.

Белковые факторы, необходимые для биосинтеза ДНК.

ДНК-связывающий белок (SSB-белок).Ослабляет взаимодействие цепей в молекуле ДНК. Активирует ДНК-полимеразы II и III.

ДНК-раскручивающий белокобладает нуклеазной активностью. Разрывает связь одной из цепей ДНК, что обеспечивает раскручивание ее молекулы.

ДНК-закручивающий белок вызывает суперспирализацию ДНК.

У эукариот открыты факторы репликации – RFA (аналог SSB-белка) и RFC – фактор, стабилизирующий репликационный комплекс.

Всего в репликации ДНК участвует более 40 ферментов и белковых факторов, объединенных в единую ДНК-репликазную систему,называемую реплисомой.

Этапы биосинтеза ДНК:

Инициация. К одноцепочечному фрагменту ДНК в момент распаривания биспиральной структуры присоединяются ДНК-связывающий белок, ДНК-раскручивающий белок, ДНК-полимеразный комплекс, праймаза и праймосома.Формируется репликативная вилка(рис. 9). На материнской цепи ДНК при участии праймазысоздается затравочный олигонуклеотид – праймер.

Элонгация.При посредстве ДНК-полимеразы III на материнской цепи ДНК синтезируется дочерняя цепь. Процесс полимеризации идет по принципу комплементарности и только в направлении 5' ® 3'.Обе цепи реплицируются одновременно. Их синтез идет в противоположных направлениях.

Рис. 9. Строение репликативной вилки

Синтез ведущей цепи ДНК осуществляется непрерывно. Отстающая цепь образуется в направлении, обратном движению репликативной вилки. Синтез происходит фрагментарно. Эти фрагменты получили название фрагментов Оказаки (в честь японского биохимика, впервые предложившего схему биосинтеза ДНК, в которой были преодолены трудности, связанные с антипараллельностью цепей ДНК в ее биспиральной молекуле). Длина фрагментов Оказаки – 150-200 тысяч нуклеотидов у эукариот и 1000-2000 – у бактерий.

Элонгация завершается отделением праймеров и замещением свободных мест комплементарными дезоксирибонуклеотидами под действием ДНК-полимеразы I. Отдельные фрагменты ДНК объединяются при помощи ДНК-лигаз.

Если бы молекула ДНК реплицировалась одним репликативным комплексом, то потребовалось бы 10 дней. Фактически репликация генома человека in vivo продолжается 6-8 ч. Репликация одновременно начинается в нескольких участках ДНК, имеющих определенную нуклеотидную последовательность и называемых ориджинами. Ориджины расположены примерно через 100000 нм. Участок ДНК между соседними ориджинами называют репликоном.Каждый репликон реплицируется двумя репликативными комплексами, движущимися навстречу друг другу. Один репликон реплицируется за 2 ч. И столько же времени потребуется для репликации молекулы ДНК любой длины.

Терминация.Существуют особые нуклеотидные последовательности, программирующие прекращение репликации ДНК.

Точность репликацииДНК – одна ошибка на 10¹⁰ реакций. Допущенная ошибка может быть исправлена в ходе репарационных процессов.

Синтез ДНК на матрице РНК

В составе онковирусов (вирус саркомы Рауса и Раушера) открыт фермент обратная транскриптаза, или ревертаза (РНК-зависимая ДНК-полимераза), катализирующий биосинтез молекулы ДНК на матрице РНК. Ревертаза нуждается в праймере, роль которого может играть тРНК.

На I этапе фермент ревертаза синтезирует на матрице вирусной РНК комплементарную цепь ДНК. Образуется так называмая гибридная молекула.

II этап - разрушение исходной вирусной РНК.

На IIIэтапе на матрице цепи ДНК комплементарно синтезируются новые цепи ДНК.

Ревертаза нашла применение в молекулярной биологии для синтеза генов и фрагментов генов и в генетической инженерии для расшифровки первичной структуры РНК и белков.

БИОСИНТЕЗ РНК

Биосинтез РНК - это процесс транскрипции,т. е. переписывания информации с ДНК-матрицы.Биосинтез РНК осуществляется на ДНК при посредстве РНК-полимераз.

У эукариототкрыты три разные РНК-полимеразы. РНК-полимераза I катализирует синтез рибосомных РНК, РНК-полимераза II - матричной РНК, РНК-полимераза III - транспортных РНК, а также ряда низкомолекулярных РНК со специфической функцией. Вместе с ферментом в единый транскрипционный комплекс объединены множество регуляторных белков (факторы транскрипции).

Все виды РНК синтезируются на ядерной ДНК в качестве матрицы.

Синтез мРНК.Одновременно на молекуле ДНК могут синтезироваться много молекул РНК. Ген эукариот наряду с кодирующими последовательностями (экзоны) содержит также некодирующие (интроны). РНК-полимераза катализирует транскрипцию как экзонов, так и интронов с образованием первичного транскрипта (РНК-предшественника). Наряду с информативными зонами они содержат неинформативные участки. В дальнейшем в ядре происходит процессинг(рис. 10),или созревание РНК. Основные этапы процессинга:

1. Кэпирование - химическая модификация 5'-концевой последовательности мРНК. «Колпачок», или «кэп», представляет собой
7-метилгуанозинтрифосфат.

2. Полиаденилирование - химическая модификация 3'-концевой последовательности мРНК. Образование поли-А-последовательности длиной
100-200 нуклеотидных остатков на 3'-конце при участии фермента поли-А-полимеразы.

Кэп и поли-А-последовательность участвуют в инициации трансляции мРНК, а также защищают мРНК от гидролиза клеточными РНКазами.

3. Сплайсинг - удаление интронов из мРНК и сшивание образующихся экзонов. Данный процесс происходит при участии малых ядерных рибонуклеопротеинов. Такие РНК называют рибозимами. Это единственные из известных макромолекул, которые наделены как информационной, так и каталитической функцией. После завершения сплайсинга мРНК поступает в цитозоль.

Рис. 10. Процессинг мРНК

Первичные транскрипты тРНКпревращаются в зрелые формы путем сплайсинга и присоединения последовательности ЦЦА, в результате чего образуется акцепторный участок. Первичный транскрипт рРНКне содержит интронов, и при действии специфических РНКаз расщепляется с образованием более мелких молекул.

Синтез РНК на матрице РНК

Вирусная РНК индуцирует образование в клетках хозяина
РНК-зависимой РНК-полимеразы (РНК-репликазы), которая участвует в репликации вирусной РНК. Пример - вирусы гриппа, бешенства, свинки, кори.

На I стадии РНК-репликаза на матрице РНК-вируса строит комплементарную цепь РНК. На II стадии она служит матрицей для синтеза РНК, однотипной исходной вирусной РНК. Обе стадии катализируются одним и тем же ферментом, хотя в каждой участвуют различные белковые факторы.

Таким образом, поиск веществ, подавляющих активность
РНК-репликазы, позволит разработать эффективные антивирусные лекарственные препараты.

БИОСИНТЕЗ БЕЛКА

Синтез белка тесно связан с понятием генетического кода.

Генетический код - свойственный всем живым организмам способ кодирования аминокислотной последовательности белков при помощи последовательности нуклеотидов.

Свойства генетического кода

1. Триплетность - единицей кода является сочетание трёх нуклеотидов (триплет, или кодон), всего 64 кодона, т.е. каждая аминокислота кодируется тремя нуклеотидами в мРНК (таблица 3).

2. Непрерывность - между триплетами нет знаков препинания, то есть информация считывается непрерывно.

3. Неперекрываемость - один и тот же нуклеотид не может входить одновременно в состав двух или более триплетов.

4. Однозначность (специфичность) - определённый кодон соответствует только одной аминокислоте (АУУ - изолейцин, УУУ - фенилаланин).

5. Вырожденность (избыточность) - одной и той же аминокислоте может соответствовать несколько кодонов (изолейцин - АУУ, АУЦ, АУА).

6. Универсальность - генетический код работает одинаково в организмах разного уровня сложности - от вирусов до человека.

Таблица 3

Генетический код (и-РНК)