Лабораторная работа № 1 «БИОХИМИЯ белков и ФЕРМЕНТОВ» Цели и задачи: изучить методы выделения и анализа веществ из биологических объектов, строение и свойства аминокислот и белков; освоить хроматографический метод исследования, объяснить возможности использования этого метода в медицинской практике; изучить вопросы организации ферментов, механизм их действия; изучить влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов; определить экспериментально активность α-амилазы слюны.
Студент должен:
- знать: правила техники безопасности работы в лаборатории биологической химии; основные методы выделения и анализа веществ; классификацию, строение, свойства аминокислот и белков; строение и основные свойства ферментов, их классификацию, современные представления о механизме действия ферментов, определение активности ферментов, единицы ее измерения, механизм влияния активаторов и ингибиторов на активность фермента; использование определения активности ферментов в клинической диагностике;
- уметь: осуществлять хроматографический анализ смеси аминокислот, проводить расчеты коэффициентов распределения; проводить эксперимент по изучению влияния активаторов и ингибиторов на активность ферментов;
- владеть: техникой лабораторных работ в лаборатории биологической химии; методикой проведения тонкослойной хроматографии, методикой сбора и анализа данных эксперимента.
Белки - это высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, молекулы которых построены из остатков аминокислот, соединенных пептидными связями. Белки составляют основу и структуры, и функций живых организмов.
При гидролизе белков образуются аминокислоты. Все многообразие белков определяется количественным и качественным содержанием различных аминокислот, взаиморасположением аминокислотных остатков в белковой молекуле.
Наиболее характерными физико-химическими свойствами белков являются высокая вязкость растворов, незначительная диффузия, способность к набуханию, оптическая активность, подвижность в электрическом поле, низкое осмотическое давление и высокое онкотическое давление. Молекулы белка не способны проникать через полупроницаемые искусственные мембраны, а также биомембраны растительных и животных тканей.
Денатурация белков-нарушение структуры нативной молекулы белка, приводящее к потере характерных для белка свойств (растворимость, биологическая активность и т.д.). Денатурация может происходить под влиянием как физических, так и химических факторов. Внешне она проявляется как потеря растворимости, особенно в изоэлектрической точке.
Простые белкипостроены из остатков аминокислот и при гидролизе распадаются соответственно только на свободные аминокислоты. К простым белкам относятся протамины и гистоны, проламины и глютелины, альбумины и глобулины.
Сложные белки -это двухкомпонентные белки, которые состоят из какого-либо простого белка и небелкового компонента. В зависимости от природы небелкового компонента выделяют нуклеопротеины, гликопротеины, липопротеины, фосфопротеины, хромопротеины, металлопротеины.
Ферменты - вещества в основном белковой природы, обладающие каталитической активностью.Ферменты ускоряют протекающие в организме реакции вследствие снижения энергетического барьера реагирующих веществ. Главное отличие ферментов от катализаторов небиологической природы состоит в исключительно высокой каталитической активности и ярко выраженной специфичности действия.
Активный центр фермента - уникальная комбинация аминокислотных остатков, которая обеспечивает непосредственное связывание активного центра с молекулой субстрата и прямое участие в акте катализа.
Существуют простые ферменты: пепсин, трипсин и др. Большинство природных ферментов относится к классу сложных белков. Небелковые компоненты – кофакторы - могут иметь различную химическую природу и различаться по прочности связи с полипептидной цепью.
Классификация ферментов основана на типе катализируемой химической реакции. В соответствии с этим все ферменты делятся на 6 классов:
1. Оксидоредуктазы.
2. Трансферазы.
3. Гидролазы.
4. Лиазы.
5. Изомеразы.
6. Лигазы.
Температура, соответствующая максимальной скорости ферментативной реакции, называется оптимальной (Тopt). Для большинства ферментов организма человека она равна
37-40 °С. При снижении температуры скорость ферментативного катализа падает, достигая при 0 °С минимальной величины. Ферменты термолабильны, т. е. чувствительны к высокой температуре. Большинство ферментов разрушается при нагревании их до 60-70 °С в течение часа, до 80-100 °С - в течение нескольких минут вследствие денатурации.
Для каждого фермента имеется определенное значение рН среды, при котором он является наиболее активным (оптимум рН). При увеличении или понижении кислотности среды активность ферментов снижается. Ферменты, как и другие белки, содержат в своем составе аминокислоты с ионогенными группами в радикалах, степень диссоциации которых зависит от рН. Изменение степени диссоциации этих групп влияет на конформацию фермента и его каталитические свойства.
Специфичность ферментов - способность катализировать строго определенное химическое превращение одного или группы сходных по строению субстратов. Основной причиной специфичности является комплементарность структуры активного центра фермента и субстрата. Абсолютная специфичность–способностьфермента катализировать единственную реакцию. Относительная (групповая) специфичность –способностьфермента катализировать превращение веществ, имеющих общие структурные особенности.
Химические соединения, увеличивающие скорость ферментативной реакции, называются активаторами. Часто активаторами ферментов являются Mg2+, Mn2+, Zn2+, K+ и Со2+.
Ингибиторы тормозят действие ферментов. Любые агенты, вызывающие денатурацию белка, приводят к необратимой инактивации фермента. Специфические ингибиторы действуют на какой-либо один фермент или группу ферментов.
Обратимое ингибирование действия ферментов может быть конкурентным и неконкурентным. Конкурентное ингибирование основано на связывании активным центром веществ, имеющих структуру, похожую на структуру субстрата. Степень ингибирования в данном случае зависит от соотношения концентрации субстрата и ингибитора. Метод конкурентного торможения широко применяется в медицинской практике (сульфаниламидные препараты).
При неконкурентном ингибировании субстрат и ингибитор связываются с разными центрами. Это приводит к изменению конформации активного центра и снижению активности фермента.
О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции. При оптимальных условиях скорость катализируемой реакции пропорциональна концентрации фермента.
Для оценки активности фермента используют стандартные международные единицы (Е или U). За единицу активности 1 U(Е) фермента принимается то количество его, которое в оптимальных условиях катализирует превращение 1 микромоль субстрата или образование 1 микромоль продукта в минуту (мкмоль/мин).
В Международной системе единиц (СИ) активность фермента выражается в каталах (кат, kat): 1 кат есть каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью, равной 1 моль/с.
1 U(Е) фермента соответствует 16,67 нкат.
Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка).
Большинство ферментов локализовано в тканях и органах, и их активность в сыворотке крови незначительна. Патологические процессы, связанные с нарушением целостности клеток, способствуют выходу ферментов в кровь. Увеличение активности ферментов сыворотки крови является диагностическим тестом, свидетельствующим о патологии определенных органов и тканей. Количественное определение активности ферментов используется в клинике с целью постановки диагноза, наблюдения за эффективностью лечения и прогноза.
Реактивы и оборудование: растворы аминокислот 0,04 М; смесь бутанола, уксусной кислоты и воды (15:3:7); 0,5% раствор нингидрина в ацетоне; пластины хроматографические;капиллярные пипетки; сосуд хроматографический с крышкой; палочки стеклянные; термостолик; спрей-камера; пульверизатор; слюна; 1% раствор хлорида натрия; 1% раствор сульфата меди; раствор Люголя; 0,5% и 0,1% растворы крахмала; пробирки; водяная баня; аналитические пипетки; мерные цилиндры.
|