Качественный анализ аминокислотных смесей методом тонкослойной хроматографии.

Проводят карандашом линию на расстоянии 2 см от нижнего края хроматографической пластины. На линии на равном расстоянии размечают 4 точки. В пипетку набирают раствор первой аминокислоты. Прикасаясь кончиком пипетки к пластине в точке 1, выпускают раствор. То же проделывают для точек 2, 3, 4 с растворами оставшихся аминокислот и их смесью, каждый раз используя чистую пипетку.

Хроматограмму помещают в хроматографический сосуд, на дно которого налита смесь бутанола, уксусной кислоты и воды (15:3:7) так, чтобы край пластины был погружен в проявитель на 1 см. Сосуд плотно закрывают крышкой и оставляют в нем хроматограмму на время, за которое проявитель пройдет по ней путь снизу вверх, равный примерно 10 см. Хроматограмму вынимают из сосуда, отмечают границу фронта проявителя и высушивают на термостолике. На высушенную хроматограмму наносят в спрей-камере при помощи пульверизатора 0,5%-ный раствор нингидрина в ацетоне до равномерного (без подтеков) смачивания. Затем хроматограмму помещают на термостолик при температуре 70 °С на 15 мин. Позиции аминокислот на хроматограмме выявляются в виде сине-фиолетовых пятен.

Идентификацию аминокислот можно осуществить по значению R_f (коэффициент распределения). Для этого измеряют расстояние, пройденное проявителем от линии старта до границы фронта проявителя, а так же расстояние от точки нанесения каждой аминокислоты до центра цветного пятна, образовавшегося в результате нингидриновой реакции. Путем деления величины пути, пройденного аминокислотой на хроматограмме, на величину пути, пройденного проявителем, находят значение коэффициента распределения (R_f) каждой аминокислоты-свидетеля. Такие же расчеты проводят с аминокислотами исследуемой смеси. Сопоставляя величины R_f аминокислот-свидетелей и аминокислот исследуемой смеси, делают заключение о природе аминокислот в составе изучаемой смеси. Аминокислоты, располагающиеся на одном уровне, идентичны.

1. Зарисуйте хроматограмму.

2. Рассчитайте значения Rf для всех веществ. Сопоставьте значения.

Вывод:

2. Действие активаторов и ингибиторов на α-амилазу слюны.

В первую пробирку наливают 1 мл 1% раствора хлорида натрия, во вторую - 1 мл 1% раствора сульфата меди, в третью - 1 мл дистиллированной воды. Во все пробирки добавляют по 2 мл 0,5% раствора крахмала и по 2 капли разведенной водой слюны (1:5). Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием, помещают в водяной термостат с температурой 37 °С. Через интервалы в 1 минуту из пробирок отбирают пробы в чистые пробирки (0,3-0,5 мл) и проводят с ними реакцию с раствором Люголя. Результаты (цвет раствора) записывают в таблицу. Гидролиз проводят в течение 5 минут. Делают вывод о действии (активатор, ингибитор) исследованных добавок.

Наблюдения:

Вывод:

3. Определение активности α-амилазы слюны по Вольгемуту.

Метод основан на установлении предельного разведения раствора α-амилазы, при котором еще происходит в определенных условиях расщепление заданного количества крахмала до эритродекстрина. Методом Вольгемута можно пользоваться для определения
α-амилазы в панкреатическом соке, крови, моче и других биологических жидкостях. Но данный метод дает лишь приблизительные результаты.

Собирают слюну. 1 мл слюны помещают в пробирку, добавляют 9 мл дистиллированной воды и перемешивают. Получается раствор слюны 1:10.

В 10 пронумерованных пробирок наливают по 1 мл воды. В первую пробирку вносят 1 мл раствора слюны и перемешивают путем трехкратного втягивания и выпускания жидкости из пипетки. Затем 1 мл жидкости из первой пробирки переносят во вторую пробирку, перемешивая содержимое, как указано выше. 1 мл жидкости из второй пробирки переносят в третью и т. д. Из десятой пробирки после перемешивания 1 мл жидкости удаляют.

Во все пробирки, начиная с десятой, добавляют по 2 мл 0,1% раствора крахмала, содержимое перемешивают. Пробирки помещают в термостат при 37 °С на 30 минут.

Через 30 минут пробирки охлаждают под краном и добавляют в каждую по 1 капле раствора Люголя. Полученные данные заносят в таблицу. Отмечают пробирку с наибольшим разведением слюны, при котором произошло расщепление крахмала до эритродекстрина, дающего с йодом красно-бурое окрашивание.

Активность α-амилазы выражают количеством миллилитров 0,1% раствора крахмала, которое может расщепить 1 мл неразведенной слюны при 37 °С в течение
30 минут до стадии эритродекстрина.

Пример: если красно-бурая окраска отмечена в четвертой пробирке, где слюна разбавлена в 160 раз. 1 мл неразбавленной слюны расщепил бы в 160 раз больше раствора крахмала за 30 минут при 37 °С: 2 мл×160 = 320 мл 0,1% раствора крахмала. Условно это принимают за 320 единиц α-амилазы по Вольгемуту:

А 37°/30' = 320 ед.

Рачет:

Вывод:

Контрольные вопросы

1. Какими свойствами обладают аминокислоты?

2. Дайте определение четырех уровней структуры белка. Какие связи стабилизируют первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуру белка?

3. Что понимают под денатурацией и ренатурацией белков? Какие агенты вызывают денатурацию?

4. Дайте определение ИЭТ и ИИТ для аминокислот и белков.

5. Какое применение находит метод хроматографии в медицине?

6. Как в медицинской практике используются явления денатурации и высаливания белков?

7. Почему для плода, зародыша, новорожденного особую роль играют фосфопротеины?

8. В чем различие между гликопротеинами и протеогликанами? Какие типы связей существуют между углеводными компонентами и белками?

9. Почему гликопротеины менее чувствительны к действию денатурирующих факторов, чем простые белки?

10. Рассмотрите структуру и функции гемоглобина А.

11. Почему гемоглобин зародыша и взрослого обладает разным сродством к кислороду?

12. Что лучше растворяется в воде: нуклеиновые кислоты или нуклеопротеины? Почему?

13. Какие связи удерживают полидезоксирибонуклеотидные цепи в биспиральной молекуле ДНК?

14. Какова роль ферментов в организме?

15. Что представляет собой активный центр фермента?

16. Каковы особенности действия ферментов по сравнению с действием неорганических катализаторов?

17. Почему при кипячении растворов ферментов происходит их инактивация?

18. Как можно доказать специфичность ферментов сахаразы и амилазы?

19. Какое влияние оказывает понижение рН среды на активность α-амилазы слюны и почему?

20. Какой принцип лежит в основе качественного определения ферментов?

21. Что такое активаторы и ингибиторы ферментов? Как можно исследовать их влияние на действие фермента?

22. Приведите примеры использования ферментов в медицине.