ГЛАВА 13. ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

Реакции антиген—антитело

Особенности взаимодействия антитела с ан­тигеном являются основой диагностических реакций в лабораториях. Реакция in vitro меж­ду антигеном и антителом состоит из специ­фической и неспецифической фазы. В специ­фическую фазу происходит быстрое специфи­ческое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза — более медленная, ко­торая проявляется видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен агглютинации) или преципитата в виде помутнения. Эта фаза требует наличия определенных условий (электролитов, опти­мального рН среды).

Связывание детерминанты антигена (эпито-па) с активным центром Fab-фрагмента анти­тел обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимо­действием. Прочность и количество связавше­гося антигена антителами зависят от аффин­ности, авидности антител и их валентности.

Иммунные реакции используют при диа­гностических и иммунологических исследо­ваниях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы (от лат. serum — сыворотка и logos — учение), т. е. методы изучения антител и антигенов с помо­щью реакций антиген—антитело, определяе­мых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма.

Обнаружение в сыворотке крови боль­ного антител против антигенов возбудите­ля позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микро­бов, различных биологически активных ве­ществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепто­ров клеток и др.

При выделении микроба от больного про­водят идентификацию возбудителя путем изу-

чения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т. е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические ан­титела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов.

В микробиологии и иммунологии широко применяются реакции агглютинации, преци­питации, нейтрализации, реакции с участи­ем комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологичес­кий, иммуноферментный, иммунофлюорес-центный методы). Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако, все они осно­ваны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления как антител, так и антигенов. Реакции иммуните­та характеризуются высокой чувствительнос­тью и специфичностью.

Ниже приводятся принципы и схемы ос­новных иммунодиагностических реакций. Детальная техника постановки реакций дана в практических руководствах по иммуноди­агностике.

Реакции агглютинации

Реакция агглютинации— РА(от лат. aggluti-natio — склеивание) — простая по постановке реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекуляр-ных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо­тонического раствора натрия хлорида.

Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировоч­ная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад­ка (клетки, «склеенные» антителами, име-

ющими два или более антигенсвязывающих центра — рис. 13.1). РА используют для:

1) определения антител в сыворотке крови боль­
ных, например, при бруцеллезе (реакции Райта,
Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реак­
ция Видаля) и других инфекционных болезнях;

2) определения возбудителя, выделенного от больного;

3) определения групп крови с использова­нием моноклональных антител против алло-антигенов эритроцитов.

Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 °С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зави­сят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диа-гностикумов (О- и //-антигенов) со специ­фическими антителами. Реакция агглютина­ции с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернис­той агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые фор­малином, сохранившие термолабильный жгу­тиковый Н-антиген) — крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации, применяя диа­гностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка истепени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе — равномерно мутной, без осадка.

Разные родственные бактерии могут агглю­тинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудня­ет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыво­ротками, из которых удалены перекрестно

реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыво­ротках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии. Получение таким способом монорецепторных диагностических агглютинирующих сывороток было предло­жено А. Кастелляни (1902).

Реакция непрямой (пассивной) гемагглюти-нации (РНГА, РПГА)основана на использова­нии эритроцитов (или латекса) с адсорбиро­ванными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соот­ветствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеива­ние и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка (рис. 13.2). При отрицательной реакции эритроци­ты оседают в виде «пуговки». Обычно в РНГА выявляют антитела с помощью антигенно­го эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбиро­ванными на них антигенами. Иногда приме­няют антительные эритроцитарные диагнос-тикумы, на которых адсорбированы антитела. Например, можно обнаружить ботулиничес-кий токсин, добавляя к нему эритроцитарный антительный ботулинический диагностикум (такую реакцию называют реакцией обратной непрямой гемагглютинации — РОНГА). РНГАприменяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гор­мона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительнос­ти к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.

Реакция коагглютинации. Клетки возбуди­теля определяют с помощью стафилококков, предварительно обработанных иммунной диагностической сывороткой. Стафилококки, содержащие белок А, имеющий сродство кFc-фрагменту иммуноглобулинов, неспеци­фически адсорбируют антимикробные анти­тела, которые затем взаимодействуют актив­ными центрами с соответствующими микро­бами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состо­ящие из стафилококков, антител диагности­ческой сыворотки и определяемого микроба.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)основана на блокаде, подавлении ан­тигенов вирусов антителами иммунной сы­воротки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты (рис. 13.3). РТГА применяют для диагностики мно­гих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещево­го энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных.

Реакцию агглютинации для определения групп крови применяют для установления системы АВО (см. разд. 10.1.4.1) с помощью агглютина­ции эритроцитов антителами иммунной сы­воротки против антигенов групп крови А (II), В (III).Контролем служат: сыворотка, не содер­жащая антител, т. е. сыворотка АВ (TV) группы крови; антигены, содержащиеся в эритроцитах групп А (II), В (III). Отрицательный контроль не содержит антигенов, т. е. используют эрит­роциты группы 0 (I).

В реакции агглютинации для определения резус-фактора (см. разд. 10.1.4.1) используют антирезусные сыворотки (не менее двух раз­личных серий). При наличии на мембране ис­следуемых эритроцитов резус-антигена проис­ходит агглютинация этих клеток. Контролем служат стандартные резус-положительные ирезус-отрицательные эритроциты всех групп крови.

Реакцию агглютинации для определения антирезусных антител (непрямую реакцию Кумбса) применяют у больных при внутрисо-судистом гемолизе. У некоторых таких боль­ных обнаруживают антирезусные антитела, которые являются неполными, одновалент­ными. Они специфически взаимодействуют с

резус-положительными эритроцитами, но не вызывают их агглютинации. Наличие таких неполных антител определяют в непрямой реакции Кумбса. Для этого в систему анти-резусные антитела + резус-положительные эритроциты добавляют антиглобулиновую сыворотку (антитела против иммуноглобули­нов человека), что вызывает агглютинацию эритроцитов (рис. 13.4). С помощью реакции Кумбса диагностируют патологические состо­яния, связанные с внутрисосудистым лизисом эритроцитов иммунного генеза, например ге­молитическую болезнь новорожденных: эрит­роциты резус-положительного плода соединя­ются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору, которые пере­шли через плаценту от резус-отрицательной матери.

Реакции преципитации

Реакция преципитации — РП(от лат. praeci-pito — осаждать) — это формирование и осаж­дение комплекса растворимого молекулярно­го антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эк­вивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.

Реакции преципитации ставят в пробирках {реакция кольцепреципитации), в гелях, пита­тельных средах и др. Широкое распростране­ние получили разновидности реакции преци­питации в полужидком геле агара или агаро-зы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектро-форез и др.

Реакция кольцепреципитации. Реакцию про­водят в узких преципитационных пробирках с иммунной сывороткой, на которую наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соот­ношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата (рис. 13.5). Избыток антигена не влияет на результат реакции кольцепреципи­тации вследствие постепенной диффузии ре­агентов к границе жидкости. Если в качестве антигенов в реакции кольцепреципитации ис­пользуют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов или тканей, то такая реакция называется реакцией термопреципита­ции (реакция Асколи, при сибирской язве).

Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони. Для постановки реакции растоп­ленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после его затверде­вания в нем вырезают лунки размером 2—3 мм. В эти лунки раздельно помешают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу. В месте встречи в эквива­лентных соотношениях они образуют преципи­тат в виде белой полосы. У многокомпонентных систем между лунками с разными антигенами и антителами сыворотки появляется несколько линий преципитата; у идентичных антигенов линии преципитата сливаются; у неидентич­ных — пересекаются (рис. 13.6).

Реакция радиальной иммунодиффузии. Иммунную сыворотку с расплавленным ага­ровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в кото­рые помещают антиген в различных разведе­ниях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вок­руг лунок (рис. 13.7). Диаметр кольца преципи­тации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют для определения содержа­ния в крови иммуноглобулинов различных клас­сов, компонентов системы комплемента и др.

Иммуноэлектрофорез— сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяет­ся в геле с помощью электрофореза. Затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносят иммунную сыворотку, антитела кото­рой, диффундируя в гель, образуют в месте «встречи» с антигеном линии преципитации.

Реакция флоккуляции(по Рамону) (от лат. floccus — хлопья шерсти)— появление опалес-ценции или хлопьевидной массы (иммуноп-реципитации) в пробирке при реакции ток­син—антитоксин или анатоксин—антитоксин. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.

Иммунная электронная микроскопия— элек­тронная микроскопия микробов, чаще ви­русов, обработанных соответствующими ан­тителами. Вирусы, обработанные иммунной

сывороткой, образуют иммунные агрегаты (микропреципитаты). Вокруг вирионов обра­зуется «венчик» из антител, контрастировав-ный фосфорно-вольфрамовой кислотой или другими электронно-оптически плотными препаратами.