Деление плазмы и форменных элементов крови (ФЭК)

1. В маркированную пластиковую пробирку внести 1-2 мл крови с добавкой антикоагулянта: 0,5 % гепарина; 0,2-0,5 % Трилона Б = динатриевой соли этилендиаминотетраацетата = ЭДТАNa₂ и т.п.

2. Зафиксировав в протоколе занятия исходный объем крови, поместить пару пластиковых гильз центрифуги на чашки центрифужных весов и вставить в них пробирки с кровью.

3. Определить, какая чашка легче и, в ее гильзу, но не пробирку, добавить для уравновешивания из пипетки по каплям дистиллят. ВНИМАНИЕ! Во избежание повторения процедуры с другой чашкой, опасаться передозировки!

4. Уравновесив гильзы с пробирками, установить их в противоположные по диаметру гнезда ротора центрифуги ОПН-3.

5. Дежурный студент, убедившись, что на задней панели центрифуги переключатель скорости вращения находится в положении 2 – 3000 об/мин и, дождавшись повторения пп. 2-4 всей подгруппой, закрывает прибор крышкой и, вставив его вилку в сетевую розетку, клавишей на передней панели включает вращение ротора. Затем, повернув по часовой стрелке рычаг на циферблате таймера, устанавливает время – 7 мин., убедившись по звуку, что он действует.

6. По звонку таймера, клавишей на передней панели центрифуги – отключить прибор.

7. Дождавшись полной остановки ротора и, сняв затем крышку центрифуги, осторожно, чтоб не взмутить рыхлый осадок ФЭК, перенести свою пробирку из гильзы в штатив на столе. При наличии воды в гильзе – выплеснуть ее в раковину водопровода.

8. С помощью полуавтоматического дозатора или пипетки с грушей, аккуратно отсосать из центрифужной пробирки по возможности весь надосадок, перенося чистую плазму крови в новую маркированную пробирку для выполнения работы 6.3.3.

9. Зафиксировав в протоколе занятия полученные объемы плазмы и эритроцитов, осторожно, чтобы не вызвать гемолиза, к осадку последних добавить 2-3 мл физиологического раствора, суспендировать его и повторить операции пп. 2-7.

10. Слив надосадок в раковину водопровода, использовать однократно промытый осадок ФЭК в работе 6.3.2.

3.2. Разделение гемоглобина и теней эритроцитов (дежурная пара)

1. Добавить к осадку ФЭК 2 объема дистиллята и 1 каплю хлороформа для ускорения осмотического гемолиза.

2. Закрыв горло пробирки пробкой, обернутой полиэтиленовой пленкой или алюминиевой фольгой, энергично встряхнуть ее содержимое и поставить пробирку в штатив на 30 мин., периодически встряхивая для ускорения полноты гемолиза.

3. Уравновесив пробирки на центрифужных весах аналогично пп. 2-7 работы 6.3.1, центрифугировать гемолизаты 15 мин. при 3000 об/мин.

4. Красный надосадок водного раствора гемоглобина количественно перенести в чистую, четко промаркированную пробирку и, закрыв ее пробкой, сдать на хранение в холодильнике лаборанту, для работ на следующих занятиях.

5. Перевернув пробирку вверх дном, подсушить плотный белесый осадок на фильтровальной бумаге.

6. Аналогично п. 4 данной работы, четко маркировать пробирку и, закрыв ее пробкой, сдать на хранение лаборанту, как препарат теней (уст. – стромы) эритроцитов. При желании, небольшую часть материала стоит микроскопировать с большим увеличением.

Определение концентрации гемоглобина (Hb) в крови

Гемиглобинцианидным методом

Принцип: Основный буферный раствор разрушает эритроциты, а феррицианид калия K₃[Fe(CN)₆] = красная кровяная соль, окисляет до трёхвалентного состояния атом Fe²⁺ гема гемоглобина = Нb. Возникший гемиглобин (Нi), или, по старой номенклатуре - метгемоглобин, реагирует с ацетонциангидрином:

с образованием гемиглобинцианида, имеющего стабильный максимум абсорбции при λ 540-546 нм, пропорциональный содержанию Hb в пробе. Метод общепринят в мировой лабораторной практике, как наилучший по сочетанию параметров. Нормальное содержание Нb в крови женщин составляет: 115 – 145 г/л, а мужчин: 132 – 164 г/л. Выпускаемые промышленностью моделигемоглобинометров, обычно основаны на том же принципе фотометрии, но имеют суженный диапазон, соответствующий максимуму А гемиглобинцианида.

Ход определения: В маркированную пробирку внести точно 5 мл трансформирующего раствора, содержащего нужные пропорции буфера, феррицианида калия и ацетонциангидрина. Затем, с помощью полуавтоматического дозатора, туда же добавить 20 мкл крови (Разведение в 251 раз). Полученной смесью многократно промыть наконечник дозатора и тщательно перемешать раствор. Пробирку оставить в штативе не менее чем на 10 мин.

Декантировать пробу в кювету ФЭКа, толщиной 10 мм и при зеленом светофильтре, против трансформирующего раствора, измерить А. Рассчитать концентрацию гемоглобина (г/л) в крови по формуле: А ^.367,7, занести результат в протокол и сделать выводы.