Определение концентрации белка биуретовым методом. Построение калибровочного графика.

Известно, что белки составляют половину и более сухой массы большинства клеток. Пластичность их полипептидной структуры позволяет белкам играть роль главных «молекулярных машин» в любой клетке и организме. Наконец белки – важнейший источник азота в питании, а, следовательно, росте и развитии консументов. Поэтому определение белка играет первичную = опорную роль во всех количественных исследованиях по энзимологии и биологии клеток, служит основой оценки физиологии и патологии организмов и их популяций, а также – важнейшим критерием оценки качества = эффективности пищевых цепей.

Соответственно задачам и возможностям лабораторий, методы измерения концентрации белков (табл. 4) многочисленны и разнообразны. Очевидно, что рефрактометрия (лат. Refractus – преломление) позволяет быстро и просто определять процентные концентрации белка в двухкомпонентных растворах. Гравиметрия – зависит от чувствительности лабораторных весов и требует чистого препарата, высушенного до постоянной массы. Принцип и формула расчета фотометрии белков в УФ, уже приводились в таблице 3.

Таблица 4

Методы измерения концентрации белков

До 70-х гг. прошлого века, наиболее точным (10^-5 г/л), считалось определение белка по количеству азота. Исходя из того, что в подавляющем большинстве белков, за исключением гистонов и протаминов, содержание азота близко к 16 %, считалось достаточным умножить найденную величину на эмпирический коэффициент 6,25 и, получить содержание белка в препарате. Однако, необходимость минерализации препарата в серной кислоте и последующее определение аммиака, занимали часы-сутки. Из-за длительности и трудоемкости этих процедур, сейчас этот метод применяют редко. По близким причинам, измерение концентраций белка на основе анализа аминокислот, используют лишь в специализированных лабораториях.

С 50-х гг. ХХ в., чаще всего в биохимической литературе цитировали работу Lowry и соавторов, предложивших измерять концентрации белков сочетанием биуретовой реакции с реактивом Фолина-Чиокалто (1927), дающим интенсивную темно-синюю окраску с тирозином, фенилаланином и, меньше с такими аминокислотами, как Три, Гис, Цис. К сожалению, его линейность, сохраняется лишь в узком диапазоне концентраций. Большинство модификаций этой методики сводится к попыткам устранить влияние специфических реагентов, применявшихся при выделении белков. В последние годы появились методы связывания красителей и флуорометрии, если в белке имеется, или, без потери нативных свойств, в него вводится соответствующий маркер. Достоинства и недостатки этих методов сведены в таблицу 5.

Таблица 5

Сравнение достоинств и недостатков методов измерения количества белка (По Р. Скоупс, 1985 с изменениями)

Количественное исследование белковых фракций крови

Биуретовым методом

Принцип метода:Пептидные группы денатурированных белков образуют в щелочной среде с ионами двухвалентной меди комплексы фиолетового цвета. Как видно из таблицы 5, интенсивность окраски пропорциональна количеству пептидных связей в пробах, в широком диапазоне концентраций белка. Однако, фотометрии мешают соли аммония, а йодиды и гликоляты меди, как и медные соли органических кислот, лучше сохраняют реагент и, специфичней к реакции с пептидными связями, чем ее сульфат. Поэтому многочисленные модификации метода различаются добавками в биуретовый реактив: йодида калия (KJ), полиолов (чаще глицерол) или солей ди- и трикарбоновых кислот (реактив Бенедикта).

Внимание! Помнить об агрессивности гидроксида натрия и приготовленного на нем биуретового реактива. В случае попадания их капель в глаза и на кожу, во избежание ожогов, промывать пораженное место проточной водой не менее 15 мин. По возможности нейтрализовать действие щелочи разбавленным (1-2 %) раствором уксусной или борной кислоты.

Ход работы: 1. В соответствии с таблицами 6 и 7, провести сквозную маркировку 8 пробирок.

2. Получить у лаборанта свои препараты белковых фракций крови, выделенных на предыдущем занятии и поместить их в штатив на рабочем столе.

3. Внести в пробирку с тенями эритроцитов 1 мл. 1н раствора гидроксида натрия, а в пробы с белковыми фракциями плазмы – по 1 мл 0,85% раствора хлорида натрия (физиологического раствора) и, оставить их в штативе, периодически помешивая.

4. В соответствии с таблицей 6, пипеткой на 1 мл внести в пробирки 1-5 указанные объемы основного стандартного раствора белка.

Таблица 6

Подготовка рабочих стандартных растворов для построения

калибровочного графика концентраций белка

5. Другой пипеткой на 1 мл, довести с помощью физиологического раствора объемы рабочих стандартов до 1мл.

6. В соответствии с таблицей 7, полуавтоматическим дозатором на 100 мкл, соответственно меняя наконечники, внести в пробирки 6-8 соответствующие объемы образцов раствора Hb, теней эритроцитов, цельной плазмы крови.

Таблица 7

Содержание в крови белковых фракций

7. В каждую из 8 рабочих пробирок внести по 5 мл биуретового реактива.

8. Тщательно перемешать их содержимое и оставить в штативе на 30 мин. для развития окраски.

9. За это время, рассчитать для таблицы 7.3 полученные концентрации рабочих стандартов белка и вычертить соответствующую сетку координат калибровочного графика.

10. За 15 мин. до начала фотометрии, соответственно разделу 4.3.1, дежурный убеждается в исправности ФЭКа КФК-2 и включает его в электросеть для прогрева.

11. Фотометрию всех рабочих растворов проводить в строгом соответствии с разделом 4.3.1, в кювете толщиной 10 мм при зеленом светофильтре (540 – 560 нм), против биуретового реактива, занося значения А рабочих стандартных растворов в таблицу 7.3 протокола занятия.

12. Значения А всех растворов препаратов внести в таблицу 7.4, для

последующих расчетов содержания соответствующих фракций в крови.

13. По данным таблицы 6 построить калибровочный график зависимости между величинами абсорбции и концентрациями растворов рабочих стандартов белка.

14. С помощью калибровочного графика определить концентрации белка в растворах фракций крови.

15. При желании, с учетом объема субстратов и добавленных к ним реагентов, подсчитать разведения фракций и рассчитать их концентрации в исходном образце крови.