Высаливание белков. Определение процентного соотношения различных белковых фракций.

Основаны на способности белков, в зависимости от прочности их гидратных оболочек, оседать из раствора при определенных концентрациях фосфатных солей. Степень помутнения растворов, определенная нефелометрией на ФЭКе КФК-2, пропорциональна содержанию белка в соответствующей фракции.

1л основного фосфатного буферного раствора содержит: 67 г. NaOH и 463,6 г. К₃РО₄. Соотношение объемов рабочих буферных растворов – в таблице 8.

Таблица 8

Состав рабочих буферных растворов.

1. В соответствии с таблицей 9 поместить в 6 пронумерованных центрифужных пробирок:

2. Пробы тщательно перемешать и, точно через 15 мин с момента добавки препаратов, измерить величины А растворов на ФЭКе с красным светофильтром, в кювете толщиной 5 мм против контроля.

3. Убедившись в надежной маркировке проб, плотно закрыть их пробками и сдать образца на хранение лаборанту для работы на следующих занятиях.

Таблица 9.

Состав проб, мл для высаливания белковых фракций плазмы

4. Для каждой фракции белков плазмы рассчитать истинное значение А по формулам: Сывороточный альбумин (СА) = А3 - А4;

α–глобулины = А4 - А5;

β–глобулины = А5 - А6;

γ–глобулины = А6.

5. Полученные истинные значения А для всех фракций суммировать и, приняв найденную величину за 100 %, рассчитать по формуле:

В норме, плазма крови млекопитающих содержит 60-80 г/л белка, из которых 35-50 г/л СА и 25-30 г/л глобулинов. Т.е. отношение альбумина к глобулинам = индекс А/Г лежит в пределах 1,5-2,3. Отсюда, относительное содержание CА в плазме крови составляет 55%, α–глобулинов – 10-18%, β–глобулинов – 8-14% и γ – глобулинов – 12-22%. Данные величины, как важнейшие константы гомеостаза, изменяются лишь при тяжелых кровопотерях, воспалительных и инфекционных заболеваниях и, крайней степени белкового голодания – маразме.

Контрольные вопросы

1. Какова природа электромагнитных излучений?

2. Какие диапазоны спектра электромагнитных излучений вам известны?

3. Каков принцип построения спектрометров?

4. В чем заключается важнейший закон физической оптики?

5. В чем состоит сила теории характеристических спектров?

6. Объясните границы применимости спектроскопии к объектам химии и биологии.

7. Что такое «видимый свет» и, как разделяют его диапазоны?

8. Какому физическому закону подчиняется свет, проходящий через раствор?

9. Что такое «фотометрический анализ» и, в каких диапазонах он проводится?

10. Какие разновидности фотометрии вам известны?

11. Чем различаются спектрофотометрия и колориметрия?

12. Сформулируйте принципы абсорбционного анализа.

13. Сформулируйте достоинства и недостатки шкал пропускания и абсорбции.

14. На какой зависимости основано определение концентрации гемоглобина гемиглобинцианидным методом?

15. На каких оптических свойствах суспензии разбавленной крови основан фотометрический счет эритроцитов?

16. Чем объяснить необходимость разбавления крови при подсчете эритроцитов, физиологическим раствором с рН 7,36?

17. Каковы нормы содержания эритроцитов и гемоглобина в крови человека?

18. Чем объяснить половой диморфизм концентраций Hb и эритроцитов у людей?

19. Возможны ли фотометрические измерения концентраций Hb и счета эритроцитов у других видов и классов животных?

20. С позиций биологии, определите понятие «ткань».

21. Какие разновидности биотканей вам известны?

22. Определите понятие «дифферон» и приведите их примеры.

23. Можно ли биохимические методы анализа назвать неразрушающими?

24. Чем различаются основные подходы к биохимическому анализу и в чем состоит залог его успеха?

25. В чем могут заключаться подготовительные операции при биохимическом анализе?

26. В каком температурном режиме хранят материал и выделяют биохимические препараты?

27. Почему нет единого алгоритма для выделения биомолекул?

28. Сформулируйте основные этапы препаративной биохимии.

29. Назовите основные этапы диагностической биохимии.

30. Какие способы разрушения тканей и клеток вам известны?

31. Почему ткани животных разрушать проще, чем клетки прокариот и ткани растений?

32. Какими приемами удаляют из гомогенатов недостаточно разрушенный материал?

33. Какие принципы могут лежать в основе разделения смеси биомолекул?

34. Какие факторы нужно учитывать при экстракции или осаждении биополимеров из смеси?

35. Что такое «высаливание» и зачем оно применяется?

36. Какие методы применимы для удаления или замены низкомолекулярных веществ в гомогенатах?

37. Что такое «молекулярные сита» и на каком принципе основано их применение? Назовите синонимы этого метода?

38. Почему различия в фазовых переходах сравнительно редко применяются к разделению биомолекул?

39. Какие методы разделения макромолекул основаны на разнице в их размерах?

40. Что такое хроматография и, какие ее разновидности вам известны?

41. Что такое «изоэлектрическая точка» и чем она отличается от понятия «изоэлектрическое состояние»?

42. Что вы знаете об электрофорезе и, чем он отличается от изоэлектрофокусирования?

43. Какие способы концентрирования растворов вам известны?

44. Как убедиться в гомогенности и нативных свойствах препарата?

Задание на дом

1. При оформлении протокола и подготовке к занятию 5, исходя из полученных Вами концентраций Hb и эритроцитов и, упростив объём эритроцита человека до цилиндра, диаметром 8 мкм и высотой 1,8 мкм, рассчитайте:

a) объём одного эритроцита;

б) сколько Нb содержится в одном эритроците;

в) сколько молекул Нb входит в один эритроцит, при его молекулярной массе - 64500 Да.

г) какую долю объёма эритроцита занимает Нb, если диаметр молекулы этого глобулярного белка составляет 6,8 нм.

2. Объясните преимущества биополимеров перед мономерами в реализации биологических функций клетки и важнейших признаков жизни.

3. Определите понятия «первичная структура» = 1^о и «конформация» полимера.

4. В соответствии с предложенным шаблоном, создайте на развороте тетради и заполните таблицу характеристик 4-х основных классов биополимеров:

5. Определите понятие «белок» и расскажите об исторической смене взглядов на их структуру, свойства и функции.

6. Что Вам известно о размерах, физико-химических свойствах и методах выделения молекул белков?

7. Какие классификации белков Вам известны?

8. Что вы знаете о многообразии глобулярных и фибриллярных, простых и сложных белков?

9. Объясните понятие «кооперативный эффект» на примере мио- и гемоглобина.

10. Определите понятие «ферменты» и объясните их различия с небиологическими катализаторами.

11. Как доказать, что доменная организации структуры гомологичных белков служит основой их функций, видовой специфичности и эволюции?

12. Насколько применимы методы исследований и понятия гидролиз, денатурация и ренативация к небелковым биополимерам?

13. Как развивались взгляды на принцип комплементарности нуклеиновых кислот, к белок-лигандным и белок-белковым взаимодействиям?

Вопросы для самоконтроля

7.4.1. Почему в биохимической практике, количественному определению белка придают первостепенное значение?

7.4.2. Какие физические принципы могут лежать в основе количественного определения белков?

7.4.3. Из каких соображений нужно исходить, выбирая метод количественного определения белка?

7.4.4. На каком принципе основан биуретовый метод определения количества белка в растворах?

7.4.5. Чем объяснить обилие модификаций биуретового метода?

7.4.6. Какие опасности возможны при определении белка биуретовым методом и, как их минимизировать?

7.4.7. Что применяется в биуретовом методе в качестве контрольного образца и почему?

7.4.8. С какой целью и как строят калибровочные графики проб стандартного ряда, в частности, для определения концентраций белка биуретовым методом?

7.4.9. Какими должны быть аминокислотный состав и физико-химические свойства белков цитоплазмы и плазмы крови, чтобы функционировать при физиологическом значении рН = 7,36?

7.4.10. Чем объяснить растворимость большинства белков крови в физрастворе, а то и дистилляте и, необходимость растворения теней эритроцитов в 1н. NaOH?

7.4.11. Что вы знаете о происхождении, структуре, свойствах и функциях СА?

7.4.12. Что вы знаете о происхождении, свойствах и функциях глобулиновых фракций плазмы крови?

7.4.13. Что вы знаете о количественном распределении белковых фракций плазмы крови?