ГЛАВА 3. ФИЗИОЛОГИЯ МИКРОБОВ
ЗЛ. Физиология бактерий
Физиология бактерий изучает жизнедеятельность, метаболизм бактерий, вопросы питания, получения энергии роста и размножения бактерий, а также их взаимодействие с окружающей средой. Метаболизм бактерий лежит в основе изучения и разработки методов их культивирования, получения чистых культур и их идентификации. Выяснение физиологии патогенных и условно-патогенных бактерий важно для изучения патогенеза вызываемых ими инфекционных болезней, для постановки микробиологической диагностики, проведения лечения и профилактики инфекционных заболеваний, регуляции взаимоотношения человека с окружающей средой, а также для использования бактерий в биотехнологических процессах с целью получения биологически активных веществ.
3.1.1. Питание бактерий Химический состав бактериальной клетки.
Бактериальная клетка на 80—90 % состоит из воды, и только 10 % приходится на долю сухого вещества. Вода в клетке находится в свободном или связанном состоянии. Она выполняет механическую роль в обеспечении тургора, участвует в гидролитических реакциях. Удаление воды из клетки путем высушивания приводит к приостановке процессов метаболизма, прекращению размножения. Высушивание микроорганизмов в вакууме из замороженного состояния (лиофилизация) прекращает размножение микробов и способствует длительному их сохранению.
Состав сухого вещества распределен следующим образом:
52% составляют белки, 17 % — углеводы, 9 % - липиды, 16 % - РНК, 3 % - ДНК и 3 % — минеральные вещества.
Белки являются ферментами, а также составной частью клетки, входят в состав цитоп-лазматической мембраны (ЦПМ) и ее произ-
водных, клеточной стенки, жгутиков, спор и некоторых капсул. Некоторые бактериальные белки являются антигенами и токсинами бактерий. В состав белков бактерий входят отсутствующие у человека Д-аминокислоты, а также диаминопимелиновая кислота.
Углеводы представлены в бактериальной клетке в виде моно-, ди-, олигосахаров и полисахаридов, а также входят в состав комплексных соединений с белками, липидами и другими соединениями. Полисахариды находятся в составе некоторых капсул, клеточной стенки; крахмал и гликоген являются запасными питательными веществами. Некоторые полисахариды принимают участие в формировании антигенов.
Липиды или жиры входят в состав ЦПМ и ее производных, клеточной стенки гра-мотрицательных бактерий, а также служат запасными веществами, входят в состав эндотоксина грамотрицательных бактерий, в составе ЛПС формируют антигены. В бактериальных жирах преобладают длинноце-почечные (С14—С18) насыщенные жирные кислоты и ненасыщенные жирные кислоты, содержащие одну двойную связь. Сложные липиды представлены фосфатидилинозитом, фосфатидилглицерином и фосфатидилэтано-ламином. У некоторых бактерий в клетке находятся воски, эфиры миколовой кислоты. Микоплазмы — единственные представители царства Procaryotae, имеющие в составе ЦПМ стеролы. Остальные бактерии в составе ЦПМ и ее производных не имеют стеролов.
Нуклеиновые кислоты. В бактериальной клетке присутствуют все типы РНК: иРНК, тРНК, рРНК. Пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды — это те строительные блоки, из которых синтезируются нуклеиновые кислоты. Кроме того, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды входят в состав многих кофермен-тов и служат для активации и переноса аминокислот, моносахаров, органических кислот.
ДНК выполняет в бактериальной клетке наследственную функцию. Молекула ДНК построена из двух полинуклеотидных цепочек. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара дезоксирибозы и фосфатной группы (рис. 3.1, а). Азотистые основания представлены пуринами(аденин, гуанин) и пиримидинами (тимин, цитозин). Каждый нуклеотид обладает полярностью. У него имеется дезоксирибозный 3'-конец и фосфатный 5'-конец. Нуклеотиды соединяются в полинуклеотидную цепочку посредством фосфодиэфирных связей между 5'-кон-иом одного нуклеотида и З'-концом другого (рис. 3.1, б). Сцепление между двумя цепями обеспечивается водородными связями между комплементарными азотистыми основаниями: аденина с тимином, гуанина с цитозином. Нуклеотидные цепи антипараллельны: на каждом из концов линейной молекулы ДНК расположен 5'-конец одной цепи и 3'-конец другой цепи. Процентное содержание количества гуанинцитозин(ГЦ)-пар в ДНК определяет степень родства между бактериями и используется при определении таксономического положения бактерий.
Минеральные вещества обнаруживаются в золе, полученной после сжигания клеток. В большом количестве представлены минеральные вещества: N, S, Р, Са, К, Mg, Fe, Mn, а также микроэлементы: Zn, Си, Со, Ва.
Азот входит в состав белков, нуклеотидов, коферментов. Сера входит в виде сульфгид-рильных групп в структуру белков. Фосфор в виде фосфатов представлен в нуклеиновых кислотах, АТФ, коферментах. В качестве активаторов ферментов используются ионы Mg, Fe, Mn. Ионы К и Mg необходимы для активации рибосом. Са является составной частью клеточной стенки грамположительных бактерий. У многих бактерий имеются сидерохро-мы, которые обеспечивают транспортировку ионов Fe внутрь клетки в виде растворимых комплексных соединений.
Классификация бактерий по типам питания и способам получения энергии. Основной целью метаболизма бактерий является рост, т. е. координированное увеличение всех компонентов клетки. Поскольку основными компонентами бактериальной клетки являются органические соединения, белки, углеводы, нуклеиновые
кислоты и липиды, остов которых построен из атомов углерода, то для роста требуется постоянный приток атомов углерода. В зависимости от источника усвояемого углерода бактерии подразделяют по типам на:
аутотрофы(от греч. autos — сам, trophe — питание), которые используют для построения своих клеток неорганический углерод, в виде СО2;
гетеротрофы (от греч. heteros — другой), которые используют органический углерод. Легко усвояемыми источниками органического углерода являются гексозы, многоатомные спирты, аминокислоты.
Белки, жиры, углеводы и нуклеиновые кислоты являются крупными полимерными молекулами, которые синтезируются из мономеров в реакциях поликонденсации, протекающих с поглощением энергии. Поэтому для восполнения своей биомассы бактериям помимо источника углерода требуется источник энергии. Энергия запасается бактериальной клеткой в форме молекул АТФ.
Организмы, для которых источником энергии является свет, называются фототрофами. Те организмы, которые получают энергию за счет окислительно-восстановительных реак-ций, называются хемотрофами.
Среди хемотрофов выделяют ли i отрофы (от греч. lithos — камень), способные использовать неорганические доноры электронов (Н2, NH3, H2S, Fe2+ и др.) и органотрофы, которые используют в качестве доноров электронов органические соединения.
Бактерии, изучаемые медицинской микробиологией, являются гетерохемоорганот-рофами. Отличительной особенностью этой группы является то, что источник углерода у них является источником энергии. Учитывая разнообразие микромира и типов метаболизма, далее изложение материала ограничено рассмотрением метаболизма у гетерохемоор-ганотрофов.
Степень гетеротрофности у различных бактерий неодинакова. Среди бактерий выделяют сапрофиты (от греч. sapros — гнилой, phyton — растение), которые питаются мертвым органическим материалом и независимы от других организмов, и паразиты (от греч. parasites — нахлебник) — гетеротрофные мик-рорганизмы, зависимые в получении питательных веществ от макроорганизма.
Среди паразитов различают облигатных и факультативных. Облигатные паразиты полностью лишены возможности жить вне клеток. К ним относятся представители родов
Rickettsia, Coxiella, Ehrlichia, Chlamydia, размножающиеся только внутри клеток макро-рганизма.
Факультативные паразиты могут жить и без хозяина и размножаться, так же как и сапрофиты, на питательных средах in vitro, т. е. вне организма.
Культивирование бактерий в системах in vitro осуществляется на питательных Средах. Искусственные питательные среды должны отвечать следующим требованиям:
1. Каждая питательная среда должна содержать воду, так как все процессы жизнедеятельности бактерий протекают в воде.
2. Для культивирования гетероорганотроф-ных бактерий в среде должен содержаться органический источник углерода и энергии. Эту функцию выполняют различные органические соединения: углеводы, аминокислоты, органические кислоты, липиды. Наибольшим энергетическим потенциалом обладает глюкоза, так как она непосредственно подвергается расщеплению с образованием АТФ и ингредиентов для биосинтетических путей. Часто используется в этих целях пептон — продукт неполного гидролиза белков, состоящий из поли-,олиго- и дипептидов. Пептон также поставляет аминокислоты для построения бактериальных белков.
3. Для синтеза белков, нуклеотидов, АТФ, коферментов бактериям требуются источники азота, серы, фосфаты и другие минеральные вещества, в том числе микроэлементы.
Источником азота может служить пептон; кроме того, большинство бактерий способны использовать соли аммония в качестве источника азота.
Серу и фосфор бактерии способны утилизировать в виде неорганических солей: сульфатов и фосфатов.
Для нормального функционирования ферментов бактериям требуются ионы Са2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, которые добавляют в питательную среду в виде солей, чаще всего фосфатов.
4. Решающее значение для роста мно
гих микроорганизмов имеет рН среды.
Поддерживание определенного рН имеет
значение для предотвращения гибели мик
роорганизмов от ими же образованных про
дуктов обмена. С этой целью питательную
среду забуферивают, чаще всего используя фосфатный буфер. При сильном выделении бактериями кислот, как продуктов обмена, добавляют к питательной среде карбонат кальция СаС12.
5. Среда должна обладать определенным ос
мотическим давлением. Большинство бакте
рий способны расти на изотоничных средах,
изотоничность которых достигается добавле
нием NaCl в концентрации 0,87 %. Некоторые
бактерии не способны расти на средах при
концентрации соли в них ниже 1 %. Такие
бактерии называются галофильными.
Так как устойчивость к осмотическому давлению определяется наличием у бактерий клеточной стенки, бактерии, лишенные клеточной стенки, микоплазмы L-формы могут расти на питательных средах, содержащих гипертонический раствор, обычно сахарозы.
При необходимости к питательной среде добавляют факторы роста, ингибиторы роста определенных бактерий, субстраты для действия ферментов, индикаторы.
6. Питательные среды должны быть сте-
рильными.
В зависимости от консистенции питатель-ные среды могут быть жидкими, полужидкими и плотными. Плотность среды достигается добавлением агара.
Агар— полисахарид, получаемый из водорослей. Он плавится при температуре 100 °С, но при охлаждении остывает при температу-ре 45—50 °С. Агар добавляют в концентрации 0.5 % — для полужидких сред и 1,5—2 % — для создания плотных сред. В зависимости от сосотава и цели применения различают простые, сложные, элективные, минимальные, диффе-ренциально-диагностические и комбинирован-ные среды.
По составу питательные среды могут быть простыми и сложными. К простым средам относятся пептонная вода, питательный бульон, мясопептонный агар. На основе этих простых сред готовят сложные, например сахарный и сывороточный бульоны, кровяной агар.
В зависимости от назначения срйды под-разделяются на элективные, обогащенные, дифференциально-диагностические.
Под элективными понимают среды, на которых лучше растет какой-то определенный
микроорганизм. Например, щелочной агар, имеющий рН 9, служит для выделения холерного вибриона. Другие бактерии, в частности кишечная палочка, из-за высокого рН на этой среде не растут.
Среды обогащения — это такие среды, которые стимулируют рост какого-то определенного микроорганизма, ингибируя рост других. Например, среда, содержащая селенит натрия, стимулирует рост бактерий рода Salmonella, ингибируя рост кишечной палочки.
Дифференциально-диагностические среды служат для изучения ферментативной активности бактерий. Они состоят из простой питательной среды с добавлением субстрата, на который должен подействовать фермент, и индикатора, меняющего свой цвет в результате ферментативного превращения субстрата. Примером таких сред являются среды Гисса, используемые для изучения способности бактерий ферментировать сахара.
Комбинированные питательные среды сочетают в себе элективную среду, подавляющую рост сопутствующей флоры, и дифференциальную среду, диагностирующую ферментативную активность выделяемого микроба. Примером таких сред служат среда Плоскирева и висмут-сульфитный агар, используемые при выделении патогенных кишечных бактерий. Обе эти среды ингибируют рост кишечной палочки.
3.1.2. Ферменты бактерий
В основе всех метаболических реакций в бактериальной клетке лежит деятельность ферментов, которые принадлежат к 6 классам: оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лигазы, лиазы, изомеразы.Ферменты, образуемые бактериальной клеткой, могут локализоваться как внутри клетки — эндоферменты,так и выделяться в окружающую среду — эк-зоферменты.Экзоферменты играют большую роль в обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь источниками углерода и энергии. Большинство гидролаз является экзоферментами, которые, выделяясь в окружающую среду, расщепляют крупные молекулы пептидов, полисахаридов, липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Ряд
экзоферментов, например гиалуронидаза, коллагеназа и другие, являются ферментами агрессии. Некоторые ферменты локализованы в периплазматическом пространстве бактериальной клетки. Они участвуют в процессах переноса веществ в бактериальную клетку. Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и — в некоторых случаях — для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности пользуются при установлении таксономического положения бактерий. Наличие экзоферментов можно определить при помощи дифференциально-диагностических сред, поэтому для идентификации бактерий разработаны специальные тест-системы, состоящие из набора дифференциально-диагностических сред.
3.1.3. Транспорт веществ в бактериальную
клетку
Для того, чтобы питательные вещества могли подвергнуться превращениям в цитоплазме клетки, они должны проникнуть в клетку через пограничные слои, отделяющие клетку от окружающей среды. Ответственность за поступление в клетку питательных веществ лежит на ЦПМ.
Существует два типа переноса веществ в бактериальную клетку: пассивный и активный.
При пассивном переносе вещество проникает в клетку только по градиенту концентрации. Затрат энергии при этом не происходит. Различают две разновидности пассивного переноса: простую диффузию и облегченную диффузию. Простая диффузия — неспецифическое проникновение веществ в клетку, при этом решающее значение имеет величина молекул и липофильность. Скорость переноса незначительна. Облегченная диффузия протекает с участием белка-переносчика. Скорость этого способа переноса зависит от концентрации вещества в наружном слое.
При активном переносе вещество проникает в клетку против градиента концентрации при помощи белка-переносчика — пермеазы. При этом происходит затрата энергии. Имеется два типа активного транспорта. При одном типе активного транс-
портанебольшие молекулы (аминокислоты, некоторые сахара) «накачиваются» в клетку и создают концентрацию, которая может в 100-1000 раз превышать концентрацию этого вещества снаружи клетки. Второй механизм, получивший название транслокация радикалов, обеспечивает включение в клетку некоторых Сахаров (например, глюкозы, фруктозы), которые в процессе переноса фосфорилируются, т. е. химически модифицируются. Для осуществления этих процессов в бактериальной клетке локализуется специальная фосфотрансфер-ная система, составной частью которой является белок-переносчик, находящийся в активной фосфорилированной форме. Фосфорилированный белок связывает свободный сахар на наружной поверхности мембраны и транспортирует его в цитоплазму, где сахар освобождается в виде фосфата. Поступив в клетку, органический источник углерода и энергии вступает в цепь биохимических реакций, в результате которых образуются АТФ и ингредиенты для биосинтетических процессов. Биосинтетические (конструктивные) и энергетические процессы протекают в клетке одновременно. Они тесно связаны между собой через общие промежуточные продукты, которые называются амфиболитами.
3.1.4 Конструктивный метаболизм
Основные органические компоненты бактериальной клетки, как уже было отмечено, синтезируются в реакциях полимеризации, из строительных блоков: аминокислот, фосфатов Сахаров, пуриновых и пиримидиновых оснований, органических кислот. Поставщиками этих строительных блоков являются промежуточные продукты основных путей энергетического метаболизма (рис. 3.2). Среди бактерий выделяется группа, называющаяся прототрофами, которые способны синтезировать все компоненты клетки из одного источника углерода и энергии. Если бактерии теряют способность к синтезу какого-нибудь фермента, участвующего в биосинтетических процессах, то для их роста и размножения требуется наличие недостающего вещества, которое называется фактором роста, а такие бактерии — ауксотрофами.
Факторами роста являются аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, витамины, которые входят в состав простети-ческих групп коферментов.
Биосинтез аминокислот.Большинство бактерий обладают способностью синтезировать все 20 аминокислот, из которых состоят белки. Белки в бактериальной клетке выполняют ферментативную функцию, а также являются составной частью структурных образований клетки: ЦПМ и ее производных, клеточной стенки, жгутиков, капсулы и спор у некоторых бактерий.
Углеродные скелеты аминокислот образуются из промежуточных продуктов обмена. Исходным материалом служат промежуточные продукты фруктозодифосфатного (ФДФ) и пентозо-фосфатного (ПФ) путей, цикл трикарбоновых кислот: пируват, кетоглутаровая кислота, окса-лоацетат, фумарат, эритрозо-4-фосфат, рибозо-4-фосфат. Аминогруппы вводятся в результате непосредственного аминирования или переа-минирования. Перевод неорганического азота в органические соединения происходит всегда через аммиак. Нитраты и нитриты и молекулярный азот предварительно восстанавливаются в
аммиак и только лишь после этого включаются в состав органических соединений.
В результате прямого аминирования образуются лишь L-аланин, L-аспартат, L-глугамат и L-глута-мин. Все остальные аминокислоты получают свою аминогруппу в результате переаминирования, с одной из «первичных» аминокислот. В большинстве случаев аминогруппа вводится на последнем этапе синтеза путем переаминирования.
Биосинтез нуклеотидов.Пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды — это те строительные блоки, из которых синтезируются нуклеиновые кислоты. Кроме того, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды входят в состав многих коферментов и служат для активации и переноса аминокислот, Сахаров, липидов в реакциях полимеризации.
Исходным соединением для образования пентозной части нуклеотидов служит рибозо-5-фосфат, образующийся в ПФ-пути.
Углеродный скелет пиримидинов происходит из аспартата, который образуется в цикле трикарбоновых кислот.
Атомы азота и аминогруппы пуринов и аминосодержащих пиримидинов происходят из аспартата и глутамина.
Биосинтез жиров.Жиры или липиды являются важными компонентами ЦПМ и клеточной стенки грамотрицательных бактерий, а также служат запасными веществами. В бактериальных жирах преобладают длинно-цепочечные (С14-С18) насыщенные жирные кислоты и ненасыщенные жирные кислоты, содержащие одну двойную связь. Сложные липиды представлены фосфатидилинозитом, фосфатидилглицерином и фосфатидилэтано-ламином.
Ключевым промежуточным продуктом для биосинтеза жирных кислот является ацетил-коэнзим А. Ключевыми промежуточными продуктами для синтеза фосфолипидов является продукт ФДФ-пути: диоксиацетил-фосфат, восстанавливающийся в глицерол-3-фосфат, который соединяется с остатками жирных кислот.
Биосинтез углеводов.Углеводы представлены в бактериальной клетке в виде моно-, ди- и полисахаридов, а также комплексных соединений. Полисахариды входят в состав некоторых капсул, крахмал и гликоген являются запасными питательными веществами.
Синтез глюкозы происходит из пирувата, за счет обратных реакций, путей распада глюкозы. Для обхода реакций, идущих только в одном направлении, имеются обходные пути, например глиоксилатный цикл.
Регуляция метаболизма у прокариот
Поскольку все реакции, протекающие в клетке, катализируются ферментами, регуляция метаболизма сводится к регуляции интенсивности ферментативных реакций. Скорость последних может регулироваться двумя основными способами: путем изменения количества ферментов и путем изменения их активности.
Биосинтетические пути, опосредованные конститутивными ферментами, регулируются аллостеричес-ким ингибированием активности первого фермента. Биосинтетические пути, опосредованные индуци-бельными ферментами, регулируются путем репрессии их синтеза конечным продуктом.
Катаболические пути, опосредованные индуцибель-ными ферментами, регулируются индукцией синтеза ферментов и катаболической репрессией, а опосредованные конститутивными ферментами — посредством аллостерических воздействий на их активность. АТФ
в этом случае является отрицательным эффектором, а АДФ — положительным эффектором.
3.1.5. Энергетический метаболизм
Энергия в бактериальной клетке накапливается в форме молекул АТФ. У хемоор-ганотрофных бактерий реакции, связанные с получением энергии в форме АТФ, — это реакции окисления-восстановления, сопряженные с реакциями фосфорилирования. Окисленный в этих реакциях углерод выделяется клеткой ввиде СO2. Для удаления отщепившегося в этих реакциях водорода, который находится в форме восстановленного НАД, различные бактерии используют различные возможности в зависимости от конечного акцептора водорода (или электронов, что является эквивалентным понятием). В зависимости от способа получения энергии у бактерий имеется несколько типов метаболизма: окислительный, или дыхание; бродильный, или ферментативный; смешанный. Тип метаболизма определяет не только реакции, в результате которых образуется АТФ, он также определяет конечные продукты этих реакций, которые используются при идентификации бактерий, а также условия культивирования бактерий.
При использовании в качестве источника углерода и энергии глюкозы или других гек-соз начальные этапы окисления глюкозы являются общими, как при оксидативном, так и при бродильном метаболизмах. К ним относятся пути превращения глюкозы в пируват (при использовании в качестве источника энергии отличных от глюкозы гексоз, или дисахари-дов, они врезультате химических превращений вступают в цепь реакций, превращающих глюкозу в пируват).
Пути расщепления глюкозы. Расщепление глюкозы до пировиноградной кислоты, одному из важнейших промежуточных продуктов обмена веществ, у бактерий происходит 3 путями (рис. 3.3):
1) через образование фруктозо-1,6-дифос-фата (ФДФ-путем, или гликолитическим распадом, или, по имени изучавших его исследователей, путем Эмбдена—Мейергофа— Парнаса);
2) через пентозофосфатный путь (ПФ-путь);
3) через путь Энтнера—Дудорова, или КДФГ-путь (путь 2-кето-3-дезокси-6-фос-фоглюконовая кислоты).
Глюкоза в бактериальной клетке сначала фосфорилируется при участии АТФ и фермента гексокиназы до метаболически активной формы глюкозо-6-фосфата (Г-6-Ф), которая служит исходным соединением для любого из трех указанных выше путей.
ФДФ-путь. Г-6-Ф изомеризуется до фруктозо-6-фосфата, который под действием фосфофруктокина-зы превращается во фруктозо-1,6-дифосфат, который в дальнейшем через образование 3-фосфоглицери-нового альдегида окисляется до пировиноградной кислоты.
Баланс окисления глюкозы по ФДФ-пути слагается из образования 2 молекул пирувата, 2 молекул АТФ и 2 молекул восстановленного НАД.
ПФ-путь. Вэтом случае глюкозо-6-фосфат через реакции дегидрирования и декарбоксилирования превращается в рибулезо-5-фосфат (Ри-5-Ф), который находится в равновесии с рибозо-5-фосфатом и ксилулозо-5-фосфатом. Ри-5-Ф расщепляется до
3-фосфоглицеринового альдегида, промежуточного продукта превращения глюкозы в пируват.
Образовавшиеся пентозофосфаты превращаются в результате транскетолазных и трансальдолазных реакций во фруктозо-6-фосфат, замыкая реакции в цикл, и в 3-фосфоглицериновый альдегид, промежуточный продукт превращения глюкозы в пируват по ФДФ-пути.
При одном обороте цикла образуется 1 молекула 3-фосфоглицеринового альдегида, 3 молекулы С02 и 2 молекулы восстановленного НАДФ.
Значение цикла заключается в подготовке важных промежуточных веществ, пентозофосфатов, эритро-зофосфатов, необходимых для синтеза нуклеиновых кислот и аминокислот, а также синтеза восстановленного НАДФ.
ПФ-путь как единственный путь расщепления глюкозы встречается у бактерий, у которых отсутствуют основные ферменты ФДФ-пути (альдолаза и трифосфатизомераза), превращающие фруктозо-1,6-дифосфат в пируват, например у некоторых видов рода Lactobacillus (L. brevis).
КДФГ-путь (путь Этнера—Дудорова) расщепления глюкозы специфичен только для бактерий. Встречается у бактерий, потерявших фермент
фосфофруктокиназу, например у бактерий рода Pseudomonas.
Процесс начинается с дегидрирования глюкозо-6-фосфата до 6-фосфоглюконовой кислоты. От нее под действием дегидрогеназы отщепляется вода и образуется 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконовая кислота (КДФГ), которая расщепляется альдолазой на пиру-ват и 3-фосфоглицериновый альдегид. Последний окисляется до пировиноградной кислоты так же, как и по ФДФ-пути.
На каждую молекулу глюкозы образуется 1 молекула АТФ, 1 молекула восстановленного НАД и 1 молекула восстановленного НАДФ, которая эквивалента 1 молекуле АТФ и 1 молекуле восстановленного НАД.
Микроорганизмы заметно различаются между собой по использованию того или иного из рассмотренных путей. Ферменты ФДФ-пути, как правило, являются обязательными компонентами клетки, хотя у многих бактерий этот путь действует лишь в обратном направлении; необратимые реакции при этом катализируются ферментами. ПФ-путь также имеет универсальное значение, так как он служит поставщиком ингредиентов для биосинтеза.
Пируват, образовавшийся при расщеплении глюкозы, превращается при участии кофакторов в «активированную» уксусную кислоту или ацетилкоэнзим А. Последний окисляется в С02 с отщеплением водорода в цикле три-карбоновых кислот.
Цикл трикарбоновых кислот выполняет не только функцию конечного окисления питательных веществ, этот цикл обеспечивает процессы биосинтеза многочисленными пред-шественникамим: пируват а-кетоглутаровая, щавелевая и янтарные кислоты — для синтеза аминокислот; щавелевоуксусная — для синтеза пиримидиновых нуклеотидов, молонат — для синтеза аминокислот, пиримидиновых нуклеотидов и жиров (рис. 3.4).
Окислительный метаболизм. Бактерии, обладающие окислительным метаболизмом, энергию получают путем дыхания.
Дыхание — процесс получения энергии в реакциях окисления-восстановления, сопряженных с реакциями окислительного фосфорилирования, при котором донорами электронов могут быть органические (у органотрофов) и неорганические (у литот-рофов) соединения, а акцептором — только неорганические соединения.
У бактерий, обладающих окислительным метаболизмом, акцептором электронов (или водорода (Н+)) является молекулярный кислород. В этом случае пируват полностью окисляется в цикле трикарбоновых кислот до С2. Цикл трикарбоновых кислот выполняет функции как поставщика предшественников для биосинте-
тических процессов, так и атомов водорода, который в форме восстановленного НАД переносится на молекулярный кислород через серию переносчиков, обладающих сложной структурно оформленной мультиферментной системой — дыхательной цепью. Дыхательная цепь у бактерий локализована в ЦПМ и во внутриклеточных мембранных структурах.
Переносчики, осуществляющие транспорт водорода (электронов) на молекулярный кислород, относятся к 4 классам дегидрогеназ, коферментами которых являются НАД, фла-вопротеины, хиноны и цитохромы. Протоны (электроны) передвигаются от одного носителя к другому в направлении увеличивающегося окислительно-восстановительного потенциала. Типичная цепь выглядит следующим образом:
ЦТК—>НАД(Н2)—>флавопротеид—>хинон -> ->цитохромы: в—>с->а—O2
Среди бактериальных цитохромов различают цитохромы в, с, а и а3. Конечным этапом переноса электронов (протонов) по дыхательной цепи является восстановление цитохромов а - а3 (цитохромоксидазы). Цитохромоксидаза является конечной оксидазой, передающей электроны на кислород. В процессе переноса электронов по цитохромам меняется валентность входящего в состав железопорфириро-ванной группы железа. Завершается перенос электронов реакцией O2 + 4F2+ 202 + 4F3+. Образующиеся при окислении ФАД или хи-нонов протоны связываются ионами О2" с образованием воды.
Образование АТФ вдыхательной цепи связывают с хемоосмотическим процессом. Особая ориентация переносчиков в ЦПМ приводит к тому, что передача водорода происходит с внутренней на внешнюю поверхность мембраны, в результате чего создается градиент атомов водорода, проявляющийся в наличии мембранного потенциала. Энергия мембранного потенциала используется для синтеза локализованной в мембране АТФазой АТФ.
В это время у эукариотов ферменты дыхательной цепи имеют относительно постоянный состав, у бактерий встречаются вариации в составе дыхательной цепи. Так, у многих бактерий вместо убихинонов имеются нафто-
хиноны, состав цитохромов может зависеть от условий роста бактерий. У некоторых бактерий цитохромы отсутствуют, и при контакте с кислородом происходит непосредственный перенос водорода на кислород с помощью флавопротеидов, конечным продуктом при этом оказывается перекись водорода — Н202.
Помимо углеводов прокариоты способны использовать другие органические соединения, в частности белки, в качестве источника энергии, окисляя их полностью до С02 и Н20.
Аминокислоты и белки также могут выступать в качестве энергетических ресурсов. Их использование связано, в первую очередь, с определенными ферментативными преобразованиями подготовительного характера. Белки вначале вне клетки расщепляются про-теолитическими ферментами на пептиды, которые поглощаются клеткой и расщепляются внутриклеточными пептидазами до аминокислот. Аминокислоты могут использоваться в конструктивном метаболизме, а могут у аммонифицирующих бактерий служить основным материалом в энергетических процессах при окислительном дезаминировании, в результате которого происходит выделение аммиака и превращение аминокислоты в кетокислоту, которая через цикл трикарбоновых кислот вступает в конструктивный метаболизм:
2R - CHNH2 - СООН + O2 -> 2R - СО --COOH + 2NH3
Процесс аммонификации известен как «гниение», при этом происходит накопление продуктов, обладающих неприятным специфическим запахом образующихся при этом первичных аминов.
Гнилостные бактерии осуществляют минерализацию белка, разлагая его до С02, NH3, H2S. К гнилостным бактериям относятся Proteus, Pseudomonas, Bacillus cereus.
Бродильный (ферментативный) метаболизм.
Ферментация, или брожение, — процесс получения энергии, при котором отщепленный от субстрата водород переносится на органические соединения.
Кислород в процессе брожения участия не принимает. Восстановленные органические соединения выделяются в питательную среду и накапливаются в ней. Ферментироваться могут углеводы, аминокислоты (за исключением ароматических), пурины, пиримидины, многоатомные спирты. Не способны сбраживаться ароматические углеводороды, стероиды, каротиноиды, жирные кислоты. Эти вещества разлагаются и окисляются только в присутствии кислорода, в анаэробных условиях они стабильны. Продуктами брожения являются кислоты, газы, спирты.
При ферментации гексоз (глюкозы) пи-руват лишь частично окисляется в цикле трикарбоновых кислот. Последний выполняет только функции поставщика предшественников для биосинтетических процессов. Энергия в форме 2 молекул АТФ образуется в результате субстратного фосфорилирования, протекающего при окислении триозофос-фата в пируват. Отщепившийся от субстрата водород, находящийся в форме восстановленного НАД, переносится на пируват, превращая его в цепи реакций в этанол, кислоты, газы. Исходя из природы конечных продуктов, различают несколько типов ферментации углеводов.
Спиртовое брожение. Встречается, в основном, у дрожжей. Конечными продуктами являются этанол и С02. Сбраживание глюкозы происходит по ФДФ-пути в анаэробных условиях. При доступе кислорода процесс брожения ослабевает, на смену ему приходит дыхание. Подавление спиртового брожения кислородом называется эффектом Пастера.
Спиртовое брожение используется в пищевой промышленности: хлебопекарной, виноделии.
Молочнокислое брожение. Различают два типа молочнокислого брожения: гомофермен-тативное и гетероферментативное.
При гомоферментативномтипе расщепление глюкозы проходит по ФДФ-пути. Водород от восстановленного НАД передается на пируват при помощи лактатдегид-рогеназы, при этом образуется молочная кислота. Гомоферментативное молочнокислое брожение происходит у S. pyogenes, E.faecalis, S. salivarius у некоторых видов рода Lactobacillus: L. dulgaricus, L. lactis.
Гетероферментативноемолочнокислое брожение присутствует у бактерий, у которых отсутствуют ферменты ФДФ-пути: альдолаза и триозофосфатизомераза. Расщепление глюкозы происходит по ПФ-пути с образованием фосфоглицеринового альдегида, который превращается далее в пируват по ФДФ-пути ив последующем восстанавливается в лактат. Дополнительными продуктами этого типа брожения являются также этанол, уксусная кислота. Гетероферментативное молочнокислое брожение встречается у различных представителей бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium.
Продукты молочнокислого брожения играют большую роль в формировании колонизационной резистентности бактериями рода Lactobacillus и Bifidobacterium, составляющих облигатную флору кишечника.
Молочнокислые бактерии широко используются в молочной промышленности для получения молочнокислых продуктов, а также в создании пробиотиков.
Муравьинокислое (смешанное) брожение. Встречается у представителей семейств Enterobacteriaceae Vibrionaceae. Глюкоза расщепляется по ФДФ-пути, глюконат расщепляется по КДФГ-пути.
|