Основные условия нормального гемопоэза

Все клетки крови живут сравнительно недолго (исключение составляют лишь Т- и В-лимфоциты памяти) и погибают, в основном, непосредственно в тканях. В то же время на протяжении всей жизни человека и животных содержание отдельных клеток крови отличается удивительным постоянством. Отсюда следует, что взамен погибающих должны вновь образовываться новые клетки крови, причем их количество должно в точности соответствовать числу прекративших существование. Вот почему в течение всей жизни человека происходит новообразование и окончательное формирование клеток крови в специальных кроветворных органах, главным из которых является костный мозг.

Количество клеток крови огромно. Только в 1 мл крови содержится 5 миллиардов эритроцитов и 5 миллионов лейкоцитов. Процесс кроветворения невероятно интенсивен и в ходе его за 1 минуту образуется 300 миллионов клеток. У здорового человека весом в 70 кг за сутки должно образовываться 2´10¹¹ эритроцитов, 45´10⁹ нейтрофилов, 10⁹ моноцитов, 175´10⁹ тромбоцитов. В течение жизни человека появляется не менее 5-6 тонн форменных элементов крови; из них на эритроциты приходится 450-460 кг, на гранулоциты 5-5,5 тонн, на лимфоциты около 275 кг и тромбоциты – до 40 кг. Приведенные цифры свидетельствуют о напряженности и интенсивности процессов кроветворения.

Как известно, в организме продуцируются клетки в 8-ми различных направлениях. При стабильном кроветворении у здорового человека соотношение между ними должно оставаться постоянным. В то же время при различных ситуациях это соотношение меняется. Так, в случае кровопотери начинают усиленно образовываться эритроциты, при воспалении – гранулоциты и т. д. Кроветворная система, эта природная универсальная фабрика, и, прежде всего, её основной производственный отдел обеспечивает образование огромного количества клеток нужного вида, в нужное время и в нужном месте.

Родоначальником всех без исключения форменных элементов крови является примитивная полипотентная или плюрипотентная стволовая кроветворная клетка (пПСК или пСКК). Стволовой она названа по аналогии с деревом, из которого растут и развиваются все его ветви. пСКК закладывается только в эмбриогенезе и расходуется последовательно, образуя короткоживущие, локально расположенные, сменяющие друг друга клеточные клоны. Согласно современным представлениям, пСКК называется клетка, способная восстановить процессы кроветворения у облученного животного. Число пСКК чрезвычайно мало – в костном мозге на 100000 клеток встречается 1 пСКК.

Какие же доказательства существуют в пользу того, что родоначальная кроветворная клетка действительно является полипотентной и способной дифференцироваться во все без исключения клетки крови?

1. Обычно заболевания крови носят клональный характер. Но при этом часто сохраняется дифференцировка клеток различных линий, и все они в таких случаях являются производными одного клона;

2. Индивидуально маркированные стволовые клетки либо с помощью чужеродного гена, либо несущие радиационный маркер, передают эту метку клеткам всех кроветворных линий дифференцировки;

3. В культуре можно создать условия, когда возникающая из одной клетки колония содержит клетки различных (числом до 6) линий дифференцировки.

Совокупность всех приведенных данных доказывает со стопроцентной уверенностью, что родоначальная стволовая кроветворная клетка действительно обладает полипотентностью.

Между тем отдел стволовых кроветворных клеток отличается значительной гетерогенностью. Установлено, что на поверхности стволовых клеток присутствует маркер CD34+, а также рецепторы для фактора стволовых клеток. В то же время среди пСКК выявляются и такие, которые не несут молекул CD34 (являются CD34-). Высказывается предположение, что они служат предшественниками CD34+ стволовых клеток. Отсюда делается вывод, что дискретный отдел стволовых клеток на самом деле является континуумом клеток, объединённых высоким, хотя и различным пролиферативным потенциалом и полипотентностью. Более того, до сих пор нет полной уверенности, что пСКК уже обнаружена; не исключено, что она располагается еще выше, на уровне гемангиобласта или мезенхимальной клетки.

За последние годы установлено, что пСКК не бессмертна и не способна, как думали прежде, к самоподдержанию, несмотря на то, что она имеет очень высокий пролиферативный потенциал, т.е. способна чрезвычайно быстро давать отдельные клоны. Однако этот потенциал не бесконечен и, как правило, одна пСКК продуцирует клон, истощающийся на протяжении месяца. Основная масса пСКК в костном мозге находится в стадии G_о клеточного цикла. При выходе из состояния покоя клетка необратимо вступает на путь дифференцировки, постепенно снижает свою способность к размножению и тем самым ограничивает набор дифференцировок. В большинстве случаев этот процесс непрерывен, однако некоторые из пСКК, после проделывания 1-3 делений, вновь возвращаются в состояние покоя. Состояние покоя этих клеток менее глубоко, и при наличии запроса они способны на него ответить значительно быстрее, приобретая маркеры дифференцировки в культуральной среде за 1-2 дня, тогда как исходные пСКК требуют для этого 10-14 дней. Следовательно, стволовые кроветворные клетки представлены двумя категориями предшественников: клетками, способными к длительной репопуляции кроветворной системы, и короткоживущими предшественниками, поддерживающими гемопоэз непродолжительное время. Говоря иначе, длительное поддерживание кроветворения обеспечивают пСКК, находящиеся в глубоком резерве, тогда как необходимость срочного ответа на запрос организма (кровопотеря, воспалительный или инфекционный процесс, тяжелая травма и т.д.) удовлетворяется за счет пСКК, пребывающих в состоянии быстро реализуемого резерва, т.е. прошедших стадии развития от G_о к G₁.

Подобное устройство кроветворной системы является наиболее целесообразным. В случае усиленного запроса на какой-либо вид клеток будет быстро развиваться клон, обладающий повышенной чувствительностью именно к требуемым в данной ситуации форменным элементам. Если бы подобных клеток не существовало, этот процесс протекал бы чрезвычайно долго, так как требуется не менее 3-4 недель для созревания пСКК до стадии колониеобразующей единицы, способной дать определенный клон форменных элементов крови.

Следует заметить, что пСКК способна выходить из костного мозга в общий кровоток. По своему строению она чрезвычайно напоминает лимфоцит, однако несет иные генетические маркеры. На 4000 лимфоцитов в периферической крови приходится 1 пСКК. В то же время на периферии процессы кроветворения осуществляться не могут, ибо для этого необходимы структурные особенности костного мозга и выделяемые им гуморальные соединения, оказывающие влияние на размножение и созревание различных клонов кроветворных клеток.

В организме происходит постоянная смена кроветворных клонов. Родоначальные клетки дифференцируются и пролиферируют последовательно, одна за другой, выходя из стадии покоя, продуцируя разные по величине клоны зрелых клеток. После же исчерпания пролиферативного запаса один клон заменяется следующим клоном. Этот процесс получил наименование сукцессия. Он свидетельствует о том, что пролиферативный потенциал пСКК ограничен.

Итак, самым примитивным предшественником клеток крови является примитивная стволовая кроветворная клетка – пСКК или pHSC(от слов primitive Hematopoietic Stem Cell). Определение её основано на способности восстанавливать нормальное кроветворение у облучённых или генетически дефектных мышей с помощью введения (пересадки) лимитирующих доз нормальных кроветворных клеток. Отсюда и другое, наиболее употребляемое название этих клеток –клетки, репопулирующие (восстанавливающие) костный мозг–КРКМ илиMRC(от слов Marrow Repopulating Cell). Даже одна такая клетка способна поддерживать кроветворение у реципиента.

КРКМ обнаружены в костном мозге взрослых животных, в селезёнке у грызунов, в эмбриональной печени.

Вторым членом отдела стволовых клеток является клетка, обеспечивающая поддержание кроветворения в длительной культуре костного мозга КИДКили LTC-IC(от слов Long-term Culture Initiating Cell). Эта клетка способна поддерживать процессы кроветворения в культуре не менее 5-7 недель.

Более зрелыми полипотентными предшественниками являются клетки, получившие образное название клеток, образующих области булыжника–КООБ или CAFC(Cobble-stone Area Forming Cell). Такое наименование они приобрели потому, что под микроскопом напоминают булыжную мостовую. Предполагается, что наиболее ранние из этих предшественников требуют для образования областей булыжников от 5 до 8 недель (КООБ5). Содержание этих клеток в кроветворных тканях примерно в 10 раз выше, чем пСКК.

Следующая полипотентная клетка, выявляемая в культуре, – КООБ2. Эта клетка образует булыжник в культуре за 10-12 дней. По маркерам распределения в организме эта клетка чрезвычайно близка (а, возможно, идентична) клетке, образующей колонии в селезёнке через 12-14 дней после трансплантации костного мозга облученным мышам. Вот почему она получила наименование КОЕ-с12или CFU-c12(от слов Colony Forming Unit Cell). Ещё более зрелым предшественником является КОЕ-с8– клетка, способная образовывать колонии в селезёнке за 7-8 дней после трансплантации.

Все эти предшественники (рис. 4) образуют отдел мультипотентных стволовых клеток.Их характеризует постепенное увеличение пролиферативной активности по мере созревания и увеличение абсолютного и относительного содержания в кроветворных тканях.

Следовательно, вместо старого представления о наличии только одного полипотентного и самоподдерживающегося предшественника – стволовой кроветворной клетки, в настоящее время выдвигается новое – о существовании целого отдела стволовых мультипотентных предшественников, ни один из которых не обладает самоподдержанием, но все они способны дифференцироваться по многим направлениям миело- и лимфопоэза.

Приведенные данные говорят о том, что на пути от стволовых клеток до первых морфологически распознаваемых клеток условно можно выделить 5-6 стадий дифференцировки.

Следующие члены кроветворной иерархии объединены в отдел олигополипотентных коммитированных клеток(они называются коммитированными, ибо ограничены в выборе возможных дифференцировок), дающих начало полипотентным колониеобразующим единицам (КОЕ). В этот отдел входят, главным образом, предшественники миелопоэза. Высказывается предположение, что существует также аналогичный отдел предшественников лимфопоэза. До сих пор остается неясным, существует ли общий предшественник Т- и В-лимфоцитов, хотя наличие таких клеток некоторыми авторами предполагается.

В отдел олигопотентных коммитированных клеток входит несколько предшественников. Первый из них – клетка, образующая в культуре колонии бластных клеток – КОЕблилиCFUbl(от слов Colony Forming Unit blasts). Название КОЕ они получили потому, что в культуре тканей продуцируют строго определенный клон клеток. За 3-4 недели они образуют небольшие колонии, состоящие приблизительно из 300-400 недифференцированных бластов. КОЕбл среди этого отдела клеток обладают наибольшим пролиферативным потенциалом.

Очень близок к КОЕбл другой предшественник – колониеобразующая единица высокого пролиферативного потенциала – КОЕ-ВПП, или HPP-CFC (от слов High Proliferatife Potential CFC). Эта клетка в культуре даёт огромные, до 1-2 мм в диаметре колонии макрофагов. КОЕ-ВПП полипотентна и способна к реклонированию.

Следующим полипотентным предшественником является клетка, дающая смешанные колонии, состоящие из эритроцитов, гранулоцитов, мегакариоцитов и макрофагов,– ГЭММ-КОЕ, или GEMM-CFC. Эта клетка способна дифференцироваться по всем направлениям миелопоэза. В этом же отделе располагаются и предшественники, более ограниченные в возможностях дифференцировки, чем ГЭММ-КОЕ. Здесь же выявляются клетки, направление дифференцировки которых в дальнейшем предопределено, но при этом выбор происходит любым случайным образом из всех возможных теоретических комбинаций. Здесь имеются предшественники, способные к дифференцировке в эритроциты и мегакариоциты, в эритроциты и гранулоциты, мегакариоциты и гранулоциты, то есть возникают от 2 до 5-потентные КОЕ в любом наборе (за исключением лимфоцитов).

В дальнейшем они превращаются в унипотентные (монопотентные) коммитированные клетки, т. е. становятся предшественниками, которые дают начало морфологически распознаваемым клонам, иными словами, дифференцируются только в одном направлении (рис. 4).

Из всего сказанного вытекает, что дифференцировка кроветворных клеток происходит не путём последовательного и упорядоченного превращения ГЭММ-КОЕ в клетки, имеющие 5 направлений дифференцировки, затем 4, 3, 2 и, наконец, только одну возможность. Нет и еще раз нет. Более того, этот процесс случайный, и отношение между шести-потентной ГЭММ-КОЕ и 2-5-потентными предшественниками, по образному выражению академика А.И. Воробьева, могут быть не типа «мать и дочь» (сын), а «брат и сестра». В процессе созревания кроветворная клетка не обязательно последовательно проходит все возможные стадии иерархического дерева; она может сразу же превратиться в монопотентный предшественник без стадии олигополипотентного. Более того, не исключено, что и пСКК в стволовом отделе не проходит всех доступных стадий дифференцировки и может в зависимости от запроса пропускать многие из них.

Все без исключения предшественники способны к размножению только при наличии специальных стимулирующих факторов, образуемых преимущественно мо­ноцитами, макрофагами, лимфоцитами и стромальными элементами костного мозга и получивших наименование цитокинов.В настоящее время обнаружен целый ряд специфических цитокинов, влияющих на процессы кроветворения и обеспечиваю­щих развитие того или иного клона клеток на поздних стадиях их формирования. К таким биологически активным соединениям относятся фактор эритропоэза – эри­тропоэтин, тромбоцитопоэза – тромбопоэтин и фактор роста и развития мегакариоцитов (Mg-CSF), фактор, влияющий на развитие мак­рофагов и моноцитов, – макрофагальный колониестимулирующий фактор (М-СSF) и другие. Известны также факторы, действующие на ранних этапах кроветворения. Это так называемый белковый фактор стила SCF или SF (от английского слова steel – стальной) или, иначе, фактор стволовых клеток (ФСК), и лейкозингибирующий фак­тор (LIF), способные оказывать влияние непосредственно на СКК и стволовые муль­типотентные клетки, вызывая их пролиферацию и переход в полиолигопотентные коммитированные клетки.

Кроме того, на пСКК действуют и другие цитокины, получившие наименование интерлейкины (IL; см. 3.11.7.), и так называемые ростовые факторы. По междуна­родной классификации интерлейкины обозначаются арабскими цифрами (IL-1, IL-2 и т.д.). На пСКК оказывают влияние IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, IL-12,а также гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF).

На полиолигопотентные коммитированные предшественники оказывает влияние IL-З и G-СSF, после чего появляется комплекс колониеобразующих единиц, объединяющий от 2 до 5 КОЕ в любых наборах. Последние и дают начало эритроцитам, зернистым лейкоцитам, моноцитам, а также тромбоцитам.

Что же касается Т и В-лимфоцитов, то они образуются из какого-либо предшественника стволовым мультипотентным клеткам, на эти клетки действует IL-1, в результате чего они могут превращаться в пре-Т- и пре-В-лимфоцит.

К позднедействующим специфическим факторам кроветворения относятся эритропоэтин, тромбопоэтин, M-CSF, G-CSF, IL-5и др.

Механизм действия ростовых факторов на процессы кроветворения был изучен только в последнее время с открытием ферментов, получивших название янускиназы (JAK).Оказалось, что при взаимодействии ростового фактора с клеткой происходит полимеризация рецептора, что сопровождается полимеризацией JAK. Последние действуют на так называемые сигналпередающие и активирующие транскрипцию молекулы (STAT),вызывая их фосфорилирование и способствуя образованию гомо- или гетеродимеров.Димеризованные STAT-молекулы попадают в ядро и связываются со строго специфическими участками молекулы ДНК, благодаря чему наступает экспрессия определённых генов. Активация JAK-молекул бывает временной, что и регулирует интенсивность процессов кроветворения.

Кроветворные клетки в костном мозге, как и клетки предшественники, собраны в гроздья, которые окружены фибробластами и эндотелиальными клетками. Созре­вая, клетки должны пробить себе путь среди расщелин, образованных фибробла­стами и эндотелиоцитами, в синусы, откуда они затем вымываются в венозную кровь.

Для того, чтобы «пробить» себе путь из костного мозга в кровь, форменные элементы должны обладать достаточной деформируемостью, ибо диаметр пор ме­жду отдельными эндотелиоцитами в 2-5 раз меньше, чем клетки крови. Несозрев­шие клетки – эритробласты, миелобласты, промиэлоциты – содержат ядра, обла­дающие ригидностью, а потому не могут пройти через отверстия между эндо­телиальными клетками костномозговых синусов. В то же время ядра зрелых клеток легко деформируются, благодаря чему они легко изменяют свою форму и без труда преодолевают барьеры на пути в циркуляцию.

Однако окружение костного мозга служит не только препятствием для выхода форменных элементов в общий кровоток. Ячейки, образованные фибробластами и эндотелиальными клетками в гроздьях костномозговых клеток, являются важней­шей частью кроветворного механизма. Так, если поместить эритроидные предшественники на ячеистую сеть костномозговых фибробластов, то клетки предшественники быстро развиваются и втискиваются между фибробластами, так как для их дифференцировки требуется плотная адгезия (прикрепление к поверхности) с окружением. Для адгезии же необходим особый белок – фибронектин, который связывает клетки предшественники с помощью особых рецепторов с поверхностью фибробластов и эндотелиальных клеток. Если такой адгезии нет, то пролиферация и дифференцировка клеток ингибируется. Кроме того, фибробласты и эндотелиальные клетки являются важнейшим источником ростовых факторов кроветворения, о чем мы неоднократно упоминали.

Говоря об основных условиях, обеспечивающих процессы кроветворения, нам хочется коснуться еще одной проблемы, связанной с функцией стромальных (мезенхимальных) клеток костного мозга. Еще в шестидесятых годах прошлого века советский ученый А. Фриденштейн обратил внимание на то, что стромальные стволовые клетки костного мозга (ССККМ) усиливают регенерацию тканей. Однако в то время вряд ли кто предполагал, насколько это открытие перевернет взгляды ученых на процессы эмбриогенеза и окажется важным для клинической медицины.

В настоящее время, благодаря исследованиям отечественных (И. Чертков, А. Фриденштейн и др.) и зарубежных ученых, установлено, что стромальные стволовые клетки костного мозга (кстати, они также обнаружены и в пуповине) не только способны поддерживать свой пул, но и дифференцироваться, если это становится необходимым, в самых различных направлениях.

В отличие от гемопоэтических стволовых клеток, стромальные (мезенхимальные) стволовые клетки обновляются чрезвычайно редко, являются долгоживущими и чрезвычайно пластичными. Хотя они и не обладают уникальными возможностями эмбриональных тканей, ССККМ способны производить громадный набор клеток.

Так, доказана возможность ССККМ переходить в хондроциты, остеобласты, адипоциты, фибробласты, кардиомиоциты, поперечно-полосатые мышцы и даже… нейроны.

Приведем лишь несколько примеров. Если ввести ССККМ в зону перелома, то они быстро превращаются в остеобласты и способствуют быстрому сращению костей.

Если больным с тяжелым инфарктом миокарда в зону повреждения ввести стромальные клетки, то очень скоро явления сердечной недостаточности исчезают. А через 8 недель эти клетки практически нельзя отличить от собственных клеток сердечной мышцы – они полностью встраиваются в её структуру и начинают функционировать как кардиомиоциты.

В экспериментах доказано, что стромальные клетки крысы при неоднократных пассажах с добавлением ростовых факторов в 80% дифференцируются в нейроны. В опытах на мышах показано, что стволовые клетки, полученные из пуповины сразу после рождения ребенка, будучи введенными мышам внутривенно, поступают в зоны повреждения головного мозга, где окончательно созревают и превращаются в нейроны. Эти эксперименты позволили предположить, что недифференцированные стромальные клетки костного мозга участвуют в репарации нервной системы. Проведены первые клинические наблюдения, показавшие, что с помощью ССККМ можно частично восстановить функции поврежденных нервных центров в результате инсульта.

Наконец, ССККМ могут быть использованы для поддержки процессов кроветворения при химио- и лучевой терапии онкологических больных, строма костного мозга у которых зачастую бывает повреждена.

Физиология эритропоэза

Эритропоэз, или «творение эритроцитов», осуществляется, как уже отмечалось, в костном мозге. В норме клеточные элементы эритропоэза размножаются чрезвычайно интенсивно; за сутки в костном мозге образуется 2´10¹¹ эритроидных клеток. При этом коммитированные эритроидные предшественники от момента образования из СКК претерпевают от 5 до 10 делений, превращаясь вначале в бурстобразующую единицу эритроцитов (БОЕэ, от слова burst – взрыв), а затем в колониеобразующую единицу эритроцитов (КОЕэ). Из КОЕэ, являющейся клеткой предшественницей эритроидного ряда, вначале появляется эритробласт, который через ряд промежуточных стадий (базофильный эритробласт I порядка, базофильный эритробласт II порядка, полихроматофильный эритробласт I порядка, полихроматофильный эритробласт II порядка, полихроматофильный нормобласт, оксифильный нормобласт) дает поколение юных эритроцитов, получивших наименование ретикулоциты (молодые эритроциты, содержащие остатки эндоплазматической сети, РНК и митохондрий, или так называемую сетчато-нитчатую субстанцию). Из одного эритробласта в результате митозов появляется от 16 до 32 ретикулоцитов. Эритроцит, достигший стадии ретикулоцита, еще в течение суток находится в костном мозге, а затем поступает в кровоток, где за 50-70 часов превращается в молодой эритроцит или нормоцит. В крови здорового человека находится не более 1% ретикулоцитов (рис. 4).

По содержанию ретикулоцитов можно судить об интенсивности эритропоэза. Если их число превышает норму, то это свидетельствует о стимуляции эритропоэза, если оказывается сниженным – то о его нарушении.

Необходимо указать, что созревание проэритробластов до стадии ретикулоцита происходит при непосредственном контакте кроветворных клеток с макрофагами костного мозга. Последние не только участвуют в доставке железа в эритробласты, а также в выделении ростовых факторов, но и способствуют фагоцитозу выталкиваемых из оксифильных нормобластов ядер.

Следует заметить, что в костном мозге наряду с образованием эритроидных предшественников (общий эритропоэз) происходит и разрушение части клеток (неэффективный эритропоэз). Величинаэффективного эритропоэза определяется числом эритроидных предшественников, достигших стадии зрелых эритроцитов. Под неэффективным эритропоэом понимается не только разрушение части ядерных эритроидных предшественников в костном мозге, но и гибель функционально неполноценных эритроцитов. Неэффективный эритропоэз является одним из физиологически обусловленных механизмов регуляции эритрона в меняющихся условиях существования человеческого и животного организма и, следовательно, обеспечивает потребности в продукции эритроцитов.