Спеціальні методи мікроскопії. Темнопольовий мікроскоп– застосовується для вивчення прозорих, слабо заломлюючих світло об'єктів, не видимих при освітленні звичайним способом. Для створення темнопольового освітлення використовуються спеціальні конденсори тебагато поля. Принцип освітлення полягає в тому, що промені прямують на об'єкт, не допускаючи попадання прямих променів в об'єктив. Дослідник спостерігає частини зображення, що світяться, на темному фоні. Межею можливостей такого способу мікроскопування є визначення частинок до 2 нм. Істотний недолік – неможливість визначити форму і внутрішню будову спостережуваних частинок.
Фазовий – котрастний мікроскоп –застосовується для вивчення малоконтрастних прозорих (зокрема, живих або нефарбованих) об'єктів, які майже не поглинають світла, тобто не змінюють амплітуду світлової хвилі, але змінюють фазу хвилі, що проходить. Проте око не може реєструвати фазових змін. За допомогою спеціального конденсора і об'єктиву вони штучно перетворюються на амплітудні, які сприймаються оком. В результаті цього створюється контрастне, чітке зображення нефарбованих структур.
Різновидами фазово-контрастного мікроскопа є інтерференційний мікроскоп,який призначений для кількістного визначення маси тканини, і диференціальний інтерференційний мікроскоп (з оптикою Номарського), який спеціально використовується для вивчення рельєфу поверхні клітин і інших біологічних об'єктів.
Фазово-контрастний і інтерференційний мікроскопи дозволяють вивчати живі клітини. У них використовується ефект інтерференції, що виникає при комбінації два наборів хвиль, який створює зображення мікроструктур. Перевагою фазово-контрастної і інтерференційної мікроскопії є можливість спостерігати клітини в процесі руху і мітозу. При цьому реєстрація руху клітин може проводитися за допомогою цейтраферної (покадрової) мікрокінозйомки.
Поляризаційний мікроскоп– виявляє в гістологічних об'єктах ізо- і анізоструктури (одинарне і подвійне променезаломлення в біологічних об'єктах). Для отримання поляризованого променя використовують, зокрема, призму Ніколя, що поміщається між джерелом світла і об'єктом. Інша призма – аналізатор знаходиться в обоймі, що обертається, між об'єктивом і окуляром. При повороті призми аналізатора на 90 градусів в полі зору залишаються видимими тільки анізотропні структури. Методом виключення визначаються ізотропні структури, які видно при нульовому положенні призми. Зображення препарату розглядається через окуляр.
Ультрафіолетовий мікроскоп– дає можливість зменшити вирішувану відстань 0,1 мкм унаслідок застосування ультрафіолетових променів. Як джерело використовують ртутно-кварцові лампи. Вся оптика мікроскопа, а також покривні і наочні стекла готуються з кварцу. У основі ультрафіолетової мікроскопії лежить виборче поглинання біологічними тканинами і клітинами короткохвильового випромінювання, унаслідок чого мікроскопування ультрафіолетових зображень дозволяє побачити їх структуру. Отримане в ультрафіолетових променях, не видиме оком зображення, перетвориться у видиме за допомогою реєстрації на фотопластині або шляхом застосування спеціальних пристроїв (люмінесцентний екран, електронно-оптичний перетворювач).
Люмінесцентний (флюоресцентний) мікроскоп– використовується для вивчення розподілу ряду хімічних компонентів в гістологічних структурах. Основою для створення цього приладу послужило явище люмінесценції, тобто збудженого свічення деяких біологічно важливих з'єднань. Будь-яка клітина живого організму володіє флюоресценцією, проте вона зазвичай буває надзвичайно слабкою. Наведена (штучна) люмінесценція виникає при обробці препаратів спеціальними барвниками – люмінофорами (акридіновий жовтогарячий). Їх концентрація настільки мала, що вони не впливають на склад і структуру препарату, а також не порушують життєдіяльність біологічних об'єктів. Це дає можливість проводити вітальні спостереження. Відповідно основ перевагою методу флюоресцентної мікроскопії є можливість спостережень цитологічних об’єктів, у тому числі і проведення на живому не фіксованому матеріалі деяких цито- і гістохімічних реакцій, причому в цьому застосуванні метод володіє високою чутливістю і специфічністю.
Електронний мікроскоп -дає можливість отримати зображення об'єктів, величина яких в середньому має близько 0,1-0,7 нм. Така висока роздільна здатність пояснюється застосуванням електронних променів. Джерелом електронів є електронна лампа без оболонки. Вольфрамова нитка катода під впливом нагріву випромінює потік електронів, який прямує в тубус. В умовах вакууму електронні промені в магнітному полі поводяться подібно до променів видимого світла в скляній призмі. Тому електромагніти електронного мікроскопа називають лінзами. Розрізняють конденсорна, об'єктивна і проекційна лінзи. Між конденсором і об'єктивом поміщають об'єкт. Електронний пучок спочатку фокусується конденсорною магнітною лінзою. Велика частина електронів, проходячи через об'єкт, фокусується другою магнітною лінзою – об'єктивною, яка дає збільшене зображення об'єкту. Це зображення збільшується третьою магнітною лінзою – проекційною. Електрони, які проходять через об'єкт, викликають свічення екрану, покритого люмінофором, проводячи на нім зображення об'єкту, тобто зображення виходить на люмінісцентному екрані. Його фотографують і, таким чином, предметом вивчення є електронна мікрофотографія. За допомогою електронного мікроскопа стало можливим вивчення ультраструктури клітин і їх похідних, макромолекул, вірусів і ін. субмікроскопічних утворень.
В даний час існують два типи електронних мікроскопів:
- растровий електронний мікроскоп
- електронний мікроскоп, що просвічує.
Так звані растрові (скануючі) електронні мікроскопи дозволяють отримати об'ємне зображення об'єктів, що вивчаються. Растровий електронний мікроскоп працює за принципом сканування електронним мікрозондом досліджуваного об'єкту, тобто послідовно «обмацувати» сфокусованим електронним променем окремі точки поверхні.
Головним достоїнством растрової електронної мікроскопії є велика глибина різкості, широкий діапазон безперервної зміни збільшення і висока роздільна здатність.
Електронний мікроскоп, що просвічує, дозволяє отримати плоске зображення досліджуваного об'єкту.
Мікрометр- використовується для вимірювання лінійних розмірів мікроскопічних об'єктів.
Контрольні питання
- Механічні частини мікроскопа: будова, призначення.
- Оптичні частини мікроскопа: будова, призначення.
- Освітлювальний апарат мікроскопа: будова дзеркала і конденсора.
- Основні властивості лінз мікроскопа. Види аберації.
- Види об'єктивів і окуляра, їх особливості.
- Визначення збільшення і роздільної здатності мікроскопа.
- Основні правила мікроскопування гістологічних препаратів.
- Принцип дії і призначення ультрафіолетового, люмінесцентного, і електронного мікроскопів.
Питання, винесені на СРС
- Принцип дії і призначення фазово-контрастної, інтерференційної, поляризаційної, темнопольової мікроскопії.
- Техніка вимірювання мікроскопічних об'єктів.
Основна література
- Луцик О.Д. Іванова А.Й., Кабак К.С. Гістологія людини. Львів: Мир, 1992. – С.8-9.
- Гістологія / Під ред. Ю.И.Афанасьева, Н.А.Юриної. М.: Медицина, 2001. С.15-18.
- Гістологія / Під ред. Ю.И.Афанасьева, Н.А.Юриної. М.: Медицина, 2001. С.10-16.
Додаткова література
1. Лабораторні заняття по курсу гістології, цитології і ембріології / Під. Ред. Ю.И.Афанасьева. М.: Вища школа. 1990. С. 7-10.
2. Напханюк В.К., Сервецкий К.Л. Практикум по цитології, загальній гістології і ембріології. Навчальний посібник. Одеса, 1999. С. 8-15
3. Практикум по гістології, цитології і ембріології / Під. Ред. Н.А.Юриної, А.И.Радостиної. М.: Вид-во УДН. 1989. С. 12-17.
- Методичні рекомендації кафедри.
Тестові завдання М1 см1 т1
1. Для вивчення прозорих, слабо заломлюючих світло об'єктів, не видимих при освітленні звичайним способом використовують:
А. Світовий мікроскоп
В. Темнопольовий мікроскоп
С. Ультрафіолетовий мікроскоп
Д. Електронний мікроскоп
Е. Поляризаційний мікроскоп
2. При дослідженні м'язової тканини виникла необхідність виявити изо- і анізотропні структури. Який вид мікроскопії для цього буде використаний?
А. Ультрафіолетовий мікроскоп
В. Флуоресцентний мікроскоп
С. Поляризаційний мікроскоп
Д. Світловий мікроскоп
Е. Фазово-контрастний мікроскоп
3. Основою для створення цього мікроскопічного приладу послужило явище люмінесценції. Який це прилад?
А. Світловий мікроскоп
В. Флуоресцентний мікроскоп
С. Електронний мікроскоп
Д. Поляризаційний мікроскоп
Е. Темнопольовий мікроскоп.
4. У експерименті використовуються живі, не забарвлені об'єкти, що містять структури, по різному заломлюють світлові промені. Який вид мікроскопії необхідно використовувати в даному випадку?
А. Електронний мікроскоп
В. Поляризаційний мікроскоп
|