Приготування постійного гістологічного препарату

Основними етапами приготування гістологічних препаратів є наступні:

1. Узяття матеріалу.

2. Фіксація.

3. Промивка.

4. Обезводнення.

5. Закладення в ущільнюючі середовища.

6. Приготування зрізів.

7. Забарвлення зрізів.

8. Обезводнення, прояснення і закладення зрізу в канадський або ялицевий бальзами для тривалого зберігання.

1. Узяття матеріалу для приготування препарату від живого організму (біопсія) або від трупа (аутопсія). Об'єкт не повинен перевищувати 1 см3.

2. Фіксацію об'єкту проводять з метою збереження структури тканини або органу, часткового ущільнення і оберігання від псування. Враховуючи вище викладене, фіксатори повинні відповідати наступним вимогам:

а) не повинні змінювати структури об'єкту

б) повинні згортати білки

в) бути бактерицидними.

Фіксатори розрізняють прості і складні.

До простихвідносяться однокомпонентні: формалін (розчин формальдегіду у воді), алкоголь, сулема і ін.

До складнихфіксаторів відносяться фіксатори, що складаються з декількох компонентів. Наприклад: 1. Ценкер-формолова суміш (сулема, формалін, біхромат калія, вода, сірчанокислий натрій). Кожен компонент цієї суміші покращує якість іншого. Наприклад: сулема є дуже хорошим фіксатором, але погано просочує тканини; біхромат калія, навпаки, слабкий фіксатор, та зате добре просочує тканини. У поєднанні вони доповнюють один одного. 2. Рідина Карнуа (спирт, формалін, крижана оцтова кислота). Час фіксації залежить від виду фіксатора, вигляду і розміру об'єкту і від цілей, які переслідує дослідник. Варіює воно від декількох хвилин до декількох днів і навіть місяців.

3. Промивка робиться з метою звільнення від фіксатора. Проводять її в проточній воді (до 1 доби).

4. Обезводнення проводять в спиртах зростаючої фортеці (від 60 до 100 градусів), щоб оберегти тканину від швидкого зморщування. 100 градусний спирт називається абсолютним. Абсолютна концентрація спирту досягається додаванням до 96-спирту вологопоглиначів: прожареного мідного купоросу або окислу кальцію.

5. Закладення в ущільнюючі середовища. Після обезводнення проводять закладення об'єкту в ущільнюючі середовища. Такими середовищами є парафін, целоїдин.

Закладення в парафін.Парафін – це тверда речовина - жировіск.

Заздалегідь об'єкт з абсолютного спирту переносять в суміш спирту з яким-небудь жиророзчинником (ксилол, хлороформ) в співвідношенні 1:1, а потім в порцію чистого жироррозчинника. Після цього об'єкт поміщають в насичений розчин парафіну в жироррозчиннику з температурою плавлення 37 градусів, званий в гістологічній практиці снігоподібною масою. У цьому розчині об'єкт слід витримати до 1 доби. Потім об'єкт на декілька годинників послідовно переносять в 2 порцію чистого парафіну з температурою плавлення 54-56 градусів (у термостаті). Після того, як об'єкт достатньо просочився парафіном, формують парафіновий блок шляхом заливки об'єкту чистою порцією парафіну в спеціальній формі з подальшим швидким охолоджуванням.

а) парафінова заливка дає можливість отримати тонкі рівномірні зрізи (2-7 мкм);

б) парафінова заливка дає можливість отримати серію зрізів, що необхідне для пошарового вивчення об'єкту.

6. Приготування зрізівпроводять на спеціальних приладах – мікротомах. Розрізняють мікротоми: а) санні; б) швейні (ротаційні).

У санному мікротомі блок зміцнюється нерухомо в об’єктоутримувачі, а мікроніж, проходячи над ним, робить зрізи. У мікротомі є мікрометричний гвинт, сполучений з об’єктутримувачі. Кожен поворот гвинта викликає відповідне переміщення вгору об’єктоутримувача з об'єктом на задану відстань (задана товщина зрізу).

У швейному мікротомі, навпаки, мікроніж закріплений нерухомо, а об’єктутримувач з об'єктом рухомо.

Отримані парафінові зрізи наклеюють на предметне скло за допомогою яєчного білка або легкого підігрівання на спиртівці або в термостаті.

7. Забарвлення зрізів.Забарвлення зрізів проводиться з метою збільшення контрастності структур, що вивчаються. Для цього зрізи необхідне депарафінувати: видалити парафін зануренням стекол в ксилол, а потім позбавитися від ксилолу послідовною промивкою в спирті і воді.

Фарба наноситься на зріз на декілька хвилин, потім змивається водою. Зазвичай використовується комбіноване забарвлення з використанням двох або декількох барвників, що вибірково офарблюють різні структури, наприклад: гематоксилін (ядра) + еозин (цитоплазма).

8. Заключення об'єкту для тривалого зберігання.

Після забарвлення зрізи промивають водою, зневоднюють спиртом, спирт видаляють ксилолом, який одночасно робить зрізи прозорими. Потім на зрізи наноситься крапля канадського або ялицевого бальзаму, після чого він покривається покривним склом і підсушується. Такі постійні гістологічні препарати можуть зберігатися протягом тривалого часу.

Особливості приготування заморожених зрізів

Звичайна гістологічна заливка триває близько 7 діб, але в деяких випадках потрібна швидка, негайна діагностика препарату (cito!). У таких випадках використовується метод заморожування. Вилучену, але нефіксовану тканину заморожують в спеціальних камерах – криостатах. За допомогою води формується крижаний блок (аналог парафінового). У криостатну камеру вмонтований мікротом, за допомогою якого виготовляють заморожені зрізи. При кімнатній температурі вони відтають і придатні для негайного гістологічного забарвлення. Такий метод дозволяє оцінитки структуру препарату протягом декількох хвилин – до півгодини. Проте метод має істотний недолік: в процесі заморожування в тканині утворюються кристали льоду, що порушують прижиттєву структуру (спотворення структури або зображення носить назва – артефакт).

Особливості приготування матеріалу для електронно-мікроскопічного дослідження

Особливості обумовлені субмікроскопічним і молекулярним рівнем дослідження. Звичайні фіксатори викликають грубу коагуляцію білків, що на електронно-мікроскопічному (ЕМ) рівні викликало б появу артефактів. Тому в ЕМ використовують фіксатори глютаральдегід або чотириокис осмію – що викликають тонку, ніжну коагуляцію білків. Як ущільнюючі середовища використовують епоксидні смоли. Приготування ультратонких зрізів (нм) проводять на спеціальних приладах ультрамікротомах за допомогою скляних або діамантових ножів.

Гістологічні барвники

Існує декілька класифікацій барвників. За походженням барвники бувають рослинними, тваринами, мінеральними. По хімічних властивостях – кислими, основними, нейтральними. Найбільше прикладне значення має класифікація барвників за призначенням. Відповідно до цієї класифікації всі барвники підрозділяються на дві групи:

I Прижиттєві(див. вищий)

- трипановий синій

- янус зелений

- метиленовий синій

- конго червоний

II Посмертні

Посмертні барвники діляться на 2 види: 1. Загальні2. Спеціальні