Спеціальні методи обробки тканин.

1. Декальцинація. Застосовується по відношенню до щільних тканин (кістка, зуб). Мета – витягання солей кальцію. Внаслідок цього об'єкт стає м'яким і придатним до різання. Декальцинація завжди проводиться після фіксації. Об'єкт поміщають в 2-10% розчин азотної кислоти на декілька днів.

2. Імпрегнація. Метод відкладення солей важких металів на яких-небудь структурах з метою їх виявлення. Застосовують солі срібла, золото. Цей метод застосовується для виявлення нервових волокон, аргірофиіьних волокон (ретикулярних, преколлагенових), клітинних меж, комплексу Гольджі.

3. Гістохімічні методи дослідження проводять з метою виявлення зміст і локалізації хімічних речовин, що входять до складу тканин, постановкою хімічної реакції безпосередньо на зрізі тканини. В результаті реакції взаємодії шуканих груп або елементів досліджуваної речовини з реактивом виходить специфічне забарвлення. Користуючись спеціальними реактивами, можна виявити амінокислотний склад білків, виявити наявність нуклеїнових кислот (ДНК, РНК), визначити наявність мікроелементів, ферментів і т.д. Наприклад: для виявлення тривалентного заліза тканину обробляють свіжо приготованою рівною сумішшю 2% фероціаніду калія (жовта кров'яна сіль) і 2% соляною кислотою.

Ділянки, в яких локалізується тривалентне залізо, забарвлюються в синій колір (берлінська блакить).

Глікозаміноглікани (ГАГ) дають реакцію метахромазії – зміна основного кольору барвника при взаємодії його з шуканою речовиною. При фарбуванні толуідиновим синім, тионіном (барвники синього кольору) ГАГ дають вишнево-червоне забарвлення. ДНК виявляється реакцією Фельгена, РНК – реакцією Браше, вуглеводні з'єднання – ШИК-РЕАКЦИЕЮ і т.д.

Цитохімія - поєднання гістохімічних методів з методом електронної мікроскопії – дозволяє вивчати локалізацію хімічних речовин на субклітинному і молекулярному рівнях.

4. Імуноцитохімічний (імунофлюоресцентний) метод – заснований на реакції антиген-антитіло. Кожна клітина організму має специфічний антигенний склад. Антитіла володіють високою специфічністю відносно антигенів, що дозволяє використовувати їх для виявлення специфічних білків. Антитіла забарвлюються флюоресцируючими барвниками і після зв’язування їх з певною структурою, препарат вивчають в люмінесцентному мікроскопі.

Антитіла можна використовувати для вивчення антигенних структур на ультрамікроскопічному рівні. Для цього антитіла мітять електронний-щільними частинками, наприклад колоїдним золотом.

Авторадіографія.

Мічені атоми широко використовуються в цитології для вивчення хімічних процесів в клітині. Наприклад: для вивчення біосинтезу білка і нуклеїнових кислот, проникності оболонки, локалізації речовин в клітині і т.д.

Для цього використовуються з'єднання, в які введена радіоактивна мітка. У молекулі міченої речовини, наприклад, амінокислоти або вуглеводу, один з атомів заміщається атомом тієї ж речовини, але радіоактивного, тобто радіоактивним ізотопом. Завдяки тому, що ці атоми поводяться в організмі також, як і що не володіють радіоактивністю, але при цьому випускають радіоактивні промені, їх можна легко виявити, застосовуючи фотографічний метод.

У цитології використовуються ізотопи водню – тритій 3Н, ізотоп вуглецю – 14С, фосфору 32Р, сірі 35S, йоду і ін., які входять до складу органічних сполук. Вводять ізотопи в організм тварин з їжею, у вигляді ін'єкцій або ж в поживне середовище при культивуванні тканин. Вони включаються в обмін речовин. Доза встановлюється досвідченим шляхом і не повинна змінювати нормальний обмін речовин. Через різні проміжки часу після введення мічених речовин фіксуються шматочки тканин і органів (суміш Каріуа або спирт-оцтова кислота 3:1). З фіксованого матеріалу готують парафінові зрізи, на поверхню яких після видалення парафіну наносять тонкий шар чутливої і фотографічної емульсії. Ця ядерна емульсія характеризується дуже дрібним розміром зерен, їх однорідністю і набагато більшим насиченням желатину, чим звичайна фотографічна емульсія.

Препарати з нанесеною на них фотоемульсією експонується в темноті при температурі 4 градуси, а потім промиваються і закріплюються також, як і звичайні фотографії.

Під час експозиції препаратів вивчення радіоактивних ізотопів, які включилися в ті або інші структури клітини, залишає слід від пробігу радіоакт. частинок в шарі фотоемульсії. В процесі прояву зерна, які опинилися в місцях пробігу радіоакт. частинок, відновлюються проявником до металевого срібла. Останні мають чорний колір і виявляються після прояву у вигляді зерен, які знаходяться в шарі фотоемульсії над тими клітинами і структурами, в які включився радіоактивний ізотоп. Такі препарати називають радиіактографами. Після прояву і закріплення радиоактографи добре промивають у воді, а потім офарблюють одним з гістологічних барвників.

Контрольні питання

1. Методи дослідження, використовувані в сучасній гістології, цитології і ембріології.
2. Вітальні методи дослідження. Культивування in vivo і in vitro.
3. Основні принципи приготування препаратів для світлової мікроскопії.
4. Етапи приготування постійного гістологічного препарату.
5. Види мікропрепаратів.
6. Загальна характеристика і класифікація гістологічних барвників.
7. Гістохімічні методи дослідження.
8. Суть методу імпрегнації, декальцинації, авторадіографії.

Питання, винесені на СРС

1. Основні принципи приготування препаратів для електронної мікроскопії.
2. Кількісні методи дослідження.
3. Поняття про імунофлюоресцентні, цитоспектрофотометричні, ауторадіографічні методи і їх використання.

Основна література

1. Луцик О.Д. Іванова А.Й., Кабак К.С. Гістологія людини. Львів. Мир. 1992. С.5-11..
2. Гістологія / Під ред. Ю.И.Афанасьева, Н.А.Юриної. М.: Медицина, 2001. С.16-23.
3. Гістологія / Під ред. Ю.И.Афанасьєва, Н.А.Юриної. М.: Медицина, 1989.С. 9-14.

Додаткова література

1. Лабораторні заняття по курсу гістології, цитології і ембріології / Під. Ред. Ю.И.Афанасьева. М.: Вища школа. 1990. С. 15-22.
2. Напханюк В.К., Сервецкий К.Л. Практикум по цитології, загальній гістології і ембріології. Навчальний посібник. Одеса, 1999. С. 16-23.
3. Практикум по гістології, цитології і ембріології / Під. Ред. Н.А.Юриної, А.И. Радостиної. М.: Вид-во УДН. 1989. С. 5-11.
4. Методичні рекомендації кафедри.

8. Напханюк В.К. Основи цитології, загальної гістології і ембріології (курс лекцій). Одесса.1999. С.14-18.

Тестові завдання М1 см1 т2

1. Досліджується вплив лікарського препарату на клітинну рухливість. Який з перерахованих методів дозволяє спостерігати переміщення клітин?

А. Імпрегнація

В. Декальцинація

С. Культивування

D. Авторадіографія

Е. Цитофотометрія

2. Природжені порушення обміну речовин характеризуються накопиченням певних з'єднань в тканинах хворого. Зокрема, при синдромі Марфана спостерігаєтьс накопичення в сполучній тканині глікозаміногліканів. Який з перерахованих методів дозволить визначити кількість речовини на зрізі тканини?

А. Імпрегнація

В. Декальцинація

С. Культивування

D. Авторадіографія

Е. Цитофотоспектрометрія

3. У діагностичній лабораторії при вивченні пунктата червоного кісткового мозку виявлені клітини еритроцитарного ряду з різко вираженою базофілією цитоплазми. Чим може бути обумовлене це явище?

А. Концентрацію білка

В. Наявністю комплексу Гольджі

С. Наявністю ліпідних включень

D. Високим рівнем глікозаміногліканів

Е. Високим рівнем РНК

4. Для вивчення реагування ізольованих живих клітин на дію лікарського препарату, що розробляється, використовується метод культивування «in vitro». Яка з перерахованих умов не вимагає строгого дотримання?

А. Температурний режим

В. Стерильність

С. Режим освітлення

D. Поживне середовище

Е. Періодичні пасажі

4. Багато захворювань, пов'язаних з порушенням обміну речовин, супроводжуються надмірним накопиченням певних з'єднань в тканинах організму. Який метод виявляє наявність і топографію даної хімічної сполуки на клітинному і тканинному рівнях?

А. Морфометричний

В. Авторадіографічний

С. Гістохімічний

D. Декальцинація

Е. Імпрегнація

5. Для синдрому Марфана характерне порушення обміну глікозаміногліканів сполучної тканини, що приводить до їх накопичення в організмі. Який гістологічний метод дозволить виявити ці з'єднання на зрізі тканини?

А. Імпрегнація сріблом

В. Реакція метахромазії

С. Реакція Фельгена

D. Забарвлення резорцин-фуксином

Е. Забарвлення по Шморлю

6. Для діагностики хромосомних захворювань досліджується каріотип людини в метафазі мітозу, коли найчіткіше видно структура хромосом. Який барвник слід застосувати для виявлення хромособагато матеріалу?

А. Осмієвая кислота

В. Пікринова кислота

С. Залізний гематоксилін

D. Кислий фуксин

Е. Кармін Беста

7. Для підтвердження клінічного діагнозу злоякісної пухлини у хворого під час операції був узятий матеріал для гістологічної експрес-діагностики. Який матеріал в даному випадку використовується як ущільнююче середовище?

А. Парафін

В. Целоідин

С. Епоксидна смола

D. Лід

Е. Канадський бальзам

8. Для підтвердження клінічного діагнозу злоякісної пухлини у хворого під час операції був узятий матеріал для гістологічної експрес-діагностики. Який прилад використовується для приготування зрізів в цьому випадку?

А. Ротаційний мікротом

В. Санний мікротом

С. Ультрамікротом

D. Кріостат

Е. Вібротом

9. Одним з критеріїв оцінки морфофункціонального стану нервової клітини служить стан «хроматофільної субстанції», що є на електронно-мікроскопічному рівні гранулярну ЕПС. Який барвник дозволить виявити ці структури на світлооптичому рівні?

А. Лужний

В. Кислий

С. Нейтральний

D. Прижиттєвий

Е. Спеціальний

10. Метод тканинної або органної культури часто використовують для дослідження механізмів ембріонального диференціювання і морфогенезу. При цьому для підвищення інтенсивності проліферативних процесів поживне середовище повинне містити:

А. Нуклеїнові кислоти

В. Амінокислоти

С. Глюкозу

D. Ембріональний екстракт

Е. Плазму крові

11. У експерименті гістологічними методами вивчалися процеси синтезу стероїдних (жирової природи) гормонів наднирковими. Який барвник потрібно використовувати для виявлення жирових включень?

А. Пікринову кислоту

В. Осмієву кислоту

С. Муцикармін

D. Орсеїн

Е. Резорцин-фуксин

12. У експерименті на тварині вивчався стан еластичного каркаса аорти під впливом різних хімічних і фізичних чинників. Який барвник дозволить виявити еластичні волокна в гістологічному препараті?

А. Пікринова кислота

В. Осмієва кислота

С. Муцикармін

D. Сафранін

Е. Резорцин-фуксин

13. Під час приготування постійного гістологічного препарату перед забарвленням проводять депарафінування зрізів. Яка хімічна речовина зазвичай використовується для цієї мети?

А. Етиловий спирт

В. Ксилол

С. Оцтова кислота

D. Фенол

Е. Глютаральдегід

14. У клінічних лабораторіях для встановлення або підтвердження діагнозу використовується гістологічне дослідження. Який з нижче перерахованих об'єктів не є препаратом?

А. Зрізи

В. Мазки

С. Плівки

D. Відбитки

Е. Навіски

15. У клінічних лабораторіях для встановлення або підтвердження діагнозу використовується дослідження гістологічних препаратів, приготованих з фіксованих тканин. Що не відноситься до фіксуючих рідин?

А. Формалін

В. Целлоідин

С. Спирти

D. Глютаральдегід

Е. Тетраоксид осмію

16. У експериментальній медицині широке застосування знаходять прижиттєві методи дослідження клітин і тканин. Для посилення контрастності досліджуваних зразків використовуються прижиттєві барвники. До таких відноситься:

А. Янус зелений

В. Азур

С. Еозин

D. Фуксин кислий

Е. Фуксин основний

17. В експериментальній медицині широке застосування знаходять прижиттєві методи дослідження клітин і тканин. Для посилення контрастності досліджуваних зразків використовуються прижиттєві барвники, які повинні відповідати головній вимозі:

А. Бути бактерицидними

В. Бути нетоксичними

С. Швидко проникати в тканину

D. Вибірково зв'язуватися

Е. Коагулювати білки

18. У судовій і спортивній медицині для встановлення підлоги використовується метод визначення тілець Бару, що є Х-хромосомою, що конденсує, займає маргінальне положення в ядрі, або винесену з ядра у вигляді так званої «барабанної палички». Якою властивістю повинен володіти барвник, що виявляє ці структури?

А. Бути кислим

В. Бути основним

С. Бути нейтральним

D. Бути спиртним

Е. Бути водним

19. Для правильного вибору тактики операції з приводу пухлини, гістологічний аналіз новоутворення проводиться негайно (cito!). При цьому використовується метод швидкого заморожування тканини, якому властиві артефакти. Що є найбільш могутнім чинником, сприяючим появі артефактів, тобто спотворень прижиттєвої структури?

А. Відсутністю хімічній фіксації

В. Відсутністю заливки в парафін

С. Утворення кристалів льоду при заморожуванні

D. Деформація при приготуванні зрізів

Е. Деформація при відтаванні зрізів

20. У експерименті вивчалася секреторна активність слизистих клітин під впливом фізичних і хімічних чинників. Який барвник дозволить виявити ці клітини на гістологічному препараті?

А. Кармін Беста

В. Муцикармін

С. Конго червоний

D. Янус зелений

Е. Толуідиновий синій

21. Глікогенози – група природжених захворювань, що розвиваються при недостатності ряду ферментів, внаслідок чого в тканинах відбувається накопичення глікогену. Який барвник дозволить виявити його включення в цитоплазмі клітин?

А. Кармін Беста

В. Муцикармін

С. Конго червоний

D. Янус зелений

Е. Толуідиновий синій

22. У експерименті вивчалася секреторна активність келихоподібних клітин під впливом фізичних і хімічних чинників. Як виглядає цитоплазма цих клітин при забарвленні загальними барвниками?

А. Базофільною

В. Еозинофільною

С. Нейтрофільною

D. Зернистою

Е. Прозорою

23. У експерименті на тварині вивчався стан еластичного каркаса аорти під впливом різних хімічних і фізичних чинників. Як виглядатимуть еластичні волокна на гістологічному препараті при забарвленні загальними барвниками?

А. Базофільними

В. Еозинофільними

С. Нейтрофільними

D. Нефарбованими

Е. Жовтуватими

24. При вивченні м'язової тканини на препараті, забарвленому загальними барвниками гематоксиліном і еозином, м’язова, і що оточує її сполучна, і декальцинована кісткова тканини забарвлюються в рожевий колір. Якому барвникові слід віддати перевазі, щоб вибірково забарвити м'язову тканину в інший колір?

А. Пікринову кислоту

В. Осмієву кислоту

С. Резорцин-фуксин

D. Янус зелений

Е. Толуідиновий синій

25. Частим критерієм для визначення стану енергетичного обміну в клітині – тканині – органі служить оцінка стану мітохондрій. Який барвник вибірково зв'язується з цією органелою, роблячи їх доступними для вивчення на світлооптичному рівні?

А. Пікринову кислоту

В. Орсеїн

С. Конго червоний

D. Янус зелений

Е. Тріпановий синій

26. Для деяких захворювань щитовидної залози характерним є порушення обміну йоду. Який метод повинен вибрати дослідник, щоб прослідкувати етапи поглинання йоду з крові, включення його в синтез гормонів, подальше накопичення і виведення у складі гормонів в кров?

А. Морфометричний

В. Авторадіографічний

С. Гістохімічний

D. Декальцинацію

Е. Імпрегнацію

27. Імпрегнація – поширений метод класичної гістології, заснований на осадженні солей важких металів на певних структурах. Які структури з перерахованих нижче не виявить даний метод?

А. Границі клітин

В. Комплекс Гольджі

С. Нейрофібрили

D. Включення глікогену

Е. Ретикулярні волокна

28. Кістка є високо мінералізованою тканиною, не підлягає різанню на мікротомі? Який метод дозволить вивчення цієї тканини на гістологічному препараті?

А. Морфометричний

В. Авторадіографічний

С. Гістохімічний

D. Декальцинація

Е. Імпрегнація

29. Для вивчення фагоцитарної активності макрофагів в живий організм вводять частинки барвника, що активно захоплюються макрофагами і таким чином маркіруючи їх, що дозволяє в подальшому на препараті ідентифікувати ці клітини. Як називається цей метод?

А. Вітальне забарвлення

В. Суправітальне забарвлення

С. Спеціальне забарвлення

D. Іммуноцитохімія

Е. Флюорохромне забарвлення

30. Один з методів, що дозволяють вивчення закономірностей розвитку зародка, полягає в тому, що запліднену яйцеклітину трансплантують в рідину передньої камери ока піддослідної тварини і, використовуючи прозорість рогівки, спостерігають ранні стадії ембріогенезу. Як називається цей метод?

А. Клонування

В. Гібридизація

С. Гібридизація in situ

D. Культивування in vivo

Е. Культивування in vitro

31. Хворого з діагнозом макроцитарна анемія в периферійній крові виявлені еритроцити великого розміру. Який гістологічний метод дозволяє зміряти діаметр еритроцитів в мазку крові?

А. Авторадіографія

В. Цитофотометрія

С. Цитоспектрометрія

D. Морфометрія

Е. Флоуцитометрія

32. Для вивчення механізмів з вапнування кісткового матриксу експериментальній тварині ввели розчин радіоактивного фосфору 32Р. Через певний час з кістки, узятої у тварини, виготовили гістологічні зрізи. Який гістологічний метод дозволить визначити включення 32Р в кісткову тканину?

А. Реакція метахромазії

В. ШИК-реакція

С. Авторадіографія

D. Гістохімія

Е. Декальцинація

33. Для вивчення нуклеїнових кислот на зрізі печінки дослідник застосував гістохімічний метод, що дозволив одночасно виявити РНК у вигляді червоного забарвлення цитоплазми, і ДНК, – у вигляді зеленого забарвлення ядра. Який барвник був використаний?

А. Толуідиновий синій

В. Гематоксилін

С. Акридиновий оранжевий

D. Конго червоний

Е. Янус зелений

34. В результаті дефіциту ціанкобаламіну і фолієвої кислоти у хворого розвинулася пернициозна мегалобластна анемія, що характеризується порушенням синтезу ДНК в еритроїдних клітинах. Який гістохімічний метод переважно застосувати для виборчого виявлення ДНК?

А. Реакція метахромазії

В. ШИК-реакція

С. Реакція Фельгена

D. Реакція Браше

Е. Реакція Ейнарсона

5. У експерименті була пригнічена активність ферменту РНК-ПОЛИМЕРАЗИ, відповідального за транскрипцію мРНК в ядрі. Відповідно в цитоплазмі також зменшується кількість рРНК і тРНК. Який гістохімічний метод дозволяє виявити наявність РНК в цитоплазмі?

А. Реакція метахромазії

В. ШИК-реакція

С. Реакція Фельгена

D. Реакція Браше

Е. Реакція Ервідважна

36. Хвороба Гіршпрунга характеризується порушенням нервово-м'язової передачі, обумовленої відсутністю ферменту ацетилхолінестерази. Який метод застосовний для визначення ферментів на зрізах тканини?

А. Авторадіографія

В. Гістохімія

С. Імпрегнація

D. Культивування

Е. Гібридизація

37. Хвороба Гіршпрунга, природжена аномалія розвитку товстого відділу кишківника, характеризується порушенням нервово-м'язової передачі, обумовленої відсутністю ферменту ацетилхолінестерази. При підготовці матеріалу для визначення ферментів на зрізах тканини виконуються всі процедури, окрім:

А. Виготовлення заморожених зрізів

В. Відсутністю фіксації

С. Заливка в парафін

D. Заморожування

Е. Відсутністю обезводнення

38. Для багатьох наукових досліджень використовуються стовбурові клітини крові (СКК), узяті з пуповинної крові. Проте, плюрипотентна СКК морфологічно нагадує малий лімфоцит і може бути ідентифікована тільки по набору антигенів на клітинній поверхні. Як називається такий метод?

А. Авторадіографічний

В. Гістохімічний

С. Цитоспектрометричний

D. Іммуноцитохімічний

Е. Морфометричний

39. Підготовка тканин або органів, узятих для гістологічного дослідження, вимагає фіксації матеріалу, тобто збереженні його прижиттєвої структури. Яка властивість фіксатора головним чином спричиняє цей ефект?

А. Здатність швидко проникати в тканини

В. Здатність коагулювати білки

С. Здатність акумулюватися в тканині

D. Не токсичність

Е. Бактерицидність