ЗАНЯТИЕ 4. МЕТОДЫ СПЕКТРОСКОПИИ В АНАЛИЗЕ

БИОМОЛЕКУЛ И КЛЕТОК

4.1. Основы спектроскопии. Известно, что видимый свет, лишь малая часть спектра электромагнитных излучений, чьи взаимно перпендикулярные электрическая и магнитная компоненты, периодически меняются местами. Поэтому энергию кванта (ε), частоту (ν) и длину их волн (λ) объединяют жесткие зависимости (рис. 4.1). В соответствии с ними, электромагнитный спектр условно делят на частично перекрывающиеся диапазоны, отчасти зависящие от источника излучений. Так, нет принципиальной разницы между волнами одной и той же длины в ИК и микроволновом диапазонах. Но, их называют ИК-лучам при генерации тепловым прибором и относят к микроволнам, если он электронный.

Рис. 4.1. Схема шкал электромагнитного спектра

Из блок-схемы (рис. 4.2) видно, что независимо от диапазона, все спектрометры включают, т. н. оптопару: 1. источник монохромного излучения энергии с длиной волны X и 2. его приемник = детектор, преобразующий сигнал в электроток индикатора.

Третью составляющую – кювету с изучаемым образцом (3) размещают между ними, сопоставляя потоки энергии излучателя Ф_о и детектора Ф₁, для получения информации о структуре и свойствах объекта исследований. Так удалось выделить 2 класса спектров: эмиссии = испускания и абсорбции = поглощения. Известно, что по закону Г. Кирхгофа (1859) – любое вещество хорошопоглощает излучения именно тех λ,которые само испускает. В свою очередь, каждый класс излучений подразделяют на непрерывные = сплошные, полосатые и линейчатые спектры.

Эмпирические данные И. Ньютон (1666), Й. Фраунгофер (1814) и др. и закон взаимосвязи спектров поглощения и испускания, позволили Г. Кирхгофу и Р.Бунзену открыть важнейший закон физической оптики: каждый атом (функциональная группа, молекула, кристалл) испускает характерный линейчатый спектр электромагнитных волн. На этой основе была создана теория характеристических спектров, позволившая открыть He, Rb, и др. химические элементы, а в ХХ в. – сделать приборы и методы спектрального анализа универсальным инструментом изучения законов существования Вселенной (табл. 4.1).

Таблица 4.1

Характеристика основных диапазонов электромагнитного спектра

Продолжение таблицы 4.1

Применительно к химии и биологии важно, что энергия квантов излучений с λ < 1 нм, разрушает атомные ядра и химические связи, тогда как у волн длиной > 1000 нм, недостаточно энергии для изменений молекулярной структуры вещества. Поэтому основой идентификации веществ стали ИК и, реже УФ диапазоны. А в основу фоторецепции клеток и организмов, лег эволюционный отбор молекул красящих и зрительных фотопигментов, способных при поглощении квантов излучений промежуточной области, максимально изменять орбитали электронов, участвующих в образовании сопряженных двойных связей.

Как сказано выше, понятие свет относят к области электромагнитных волн в диапазоне 10^-8-10^{-6 м (рис. 4.3). Человек и другие}

млекопитающие видят лишь в небольшой части спектра, соответственно длинам волн 380 – 800 нм. Но, люди с удаленным хруcталиком, воспринимают УФ-диапазон, как и насекомые, которых привлекают, невзрачные для млекопитающих цветы. При том известно, что птицы – не видят в синей области спектра, ряд пресмыкающихся воспринимает ИК лучи, а летучие мыши и дельфины пользуются ультразвуковой эхолокацией.

Рис. 4.3. Видимая область спектра для млекопитающих

Фотометрический анализ – совокупность методов качественного и количественного анализа по интенсивности УФ, видимого и ИК излучений. Но, т.к. биообъекты на 2/3 состоят из воды, высокая теплоемкость которой поглощает ИК лучи, то в биологии их почти не применяют, широко используя 2 других диапазона (рис. 4.4).

Рис. 4.4. Схема методов фотометрии ( по http://www.krugosvet.ru/ articles/ 23/ 1002315/1002315a1.htm)

Нередко фотометрию сводят к молекулярно-абсорбционному анализу, основанному на объединенном законе светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера. Согласно ему, в стандартных условиях кюветного отделения и длины волны, перпендикулярной толщине слоя однородной среды (l), между концентрацией (С) поглощающего вещества и соотношением интенсивностей исходного = Ф₀ и достигшего детектора = Ф₁ потоков излучений, возникает логарифмическая зависимость: С = lg Ф₀/Ф₁. Отсюда появился не очень точный, но распространенный синоним – концентрационный анализ.

При стандартных λ и толщине образца, количество света достигшее фотодетектора выражают линейной шкалой светопропускания = Т (transition), которую для удобства в работе, обычно градуируют в %. К сожалению, она не имеет прямого отношения к свойствам образца, ослабляющего интенсивность излучений за счет поглощения = А (absorbtion) или, таких устаревших понятий, как оптическая плотность = D (density) раствора и коэффициент его экстинкции = Е. С другой стороны, зависимость 2 – lg T = А, обеспечивает высокую точность измерения концентраций в диапазоне 0,2-0,8 безразмерной логарифмической шкалы от 0 до ∞.

Во избежание оптических эффектов, способных исказить результаты, фотометрию проводят в закрытых кюветных отделениях фотометров, а хрупкие кюветы с плоскопараллельными стенкам – берегут от падений, царапин, потеков и капель. По той же причине, нельзя касаться руками оптических стенок кювет, а после употребления – их тщательно моют с мылом и хранят в дистилляте, высушив перед следующим измерением. Чтоб кюветы не запотевали, их заполняют растворами комнатной температуры до уровня, при котором поток света целиком проходит через раствор.

Таблица 4.2

Сравнительная характеристика фотометров

В таблице 4.2 представлены важнейшие эксплуатационные характеристики однолучевых фотометров, предназначенных для измерений в УФ и видимой областях спектра. Так как у колориметров они гораздо проще, то и стоимость их ниже, примерно на порядок. Спектрофотометрия в УФ диапазоне позволяет: 1) идентифицировать вещества по их характерным спектрам поглощения; 2) при стандартной длине УФ лучей измерять в 1 М водных растворах многих веществ, их важнейшую спектральную характеристику – молярный коэффициент абсорбции (табл. 4.3). Этот неразрушающий метод позволяет экономить препарат, сводя измерение концентраций к замеру спектральных максимумов поглощения биомолекул. Аналогично, рутинные измерения активности ферментов упрощают до т.н. теста Варбурга, определяя в стандартных условиях, прирост или убыль 1 мкмоль НАДН (НАДФН).

Таблица 4.3

Расчет концентраций биомолекул по их спектральным

характеристикам УФО

Так как большинство веществ поглощает видимый свет незначительно, то окрашенные продукты, в количестве, пропорциональном концентрации исходного вещества, получают из них после определенных физико-химических воздействий, включая качественные реакции. Этот прием широко применяют для колориметрии в относительно простых фотоэлектроколориметрах = ФЭКах. Из биомолекул, так определяют концентрации ортофосфата = неорганический фосфат (Фн) и других фосфоорганических соединений, железа, мочевины, билирубина, холестерола, жирных кислот, белка, гемоглобина и др. До недавних пор, мирясь с недостатками, так же определяли глюкозу, фруктозу, крахмал, гликоген и др. сахара, пока колориметрию углеводов не вытеснили ферментные и электрометрические метода анализа.

При колориметрии, изучаемый раствор сравнивают с поглощением: 1. контрольного образца и 2. проб стандартного ряда = шкалы сравнений или графика калибровки. В качестве контроля обычно используют растворитель или раствор со всеми компонентами, кроме исследуемого вещества. Напротив, чтобы концентрация анализируемого вещества пропорционально убывала в 3 – 5 параллельных пробах шкалы сравнений, ее готовят разведением раствора точной концентрации, с учетом чувствительности конкретного метода, температуры среды и времени развития окраски. Результаты колориметрии проб шкалы сравнений оформляют в виде графика зависимости интенсивности окраски (ось ординат) от концентрации анализируемого вещества (ось абсцисс), добиваясь его прямолинейности. За редкими исключениями, полученный график нельзя экстраполировать за пределы экспериментальных точек. Оптимизируя размер кювет нужно стремиться, чтобы значения А калибровочного графика уложились в интервале 0,1 – 1,0, а еще лучше – 0,1 – 0,6.

Так как все ФЭКи различаются степенью монохроматизации света и, соответственно, чувствительностью, недопустимо пользоваться калибровочным графиком или таблицей соотношений А и С, построенными для других ФЭКов! Больше того, калибровки, построенные с реактивами разных партий, как правило, не совпадают. Поэтому при смене реактивов, график приходится строить заново. После измерений абсорбции в опытных пробах, концентрации анализируемого вещества в них определяют в соответствии с калибровочным графиком или таблицей, с учетом объема исследуемого раствора. Если величина А пробы окажется выше имеющихся значений графика (таблицы), во избежание искажения результатов, разбавлять реакционную смесь для повторной колориметрии не рекомендуется. В этих случаях, лучше повторить колориметрический тест с меньшим объемом исследуемого материала, чтоб его результаты попали на калибровку.

4.2. Дополнительная литература

4.2.1. Спектроскопические методы исследований в физиологии и биохимии. – Л.: Наука, 1987. – 204 с.

4.2.2. Физико-химические методы молекулярной биологии. – М.: Изд-во Моск. ун-та., 1978. – С. 65 – 95; 127 –173.

4.2.3. Бурштейн Э. А. Люминесценция белковых хромофоров. – М.: ВИНИТИ «Итоги науки и техники». Серия БИОФИЗИКА. – Т. 6, 1976. – 216 с.

4.2.4. Черницкий Е. А. Люминесценция и структурная лабильность белков в растворе и клетке. – Минск.: Наука и техника, 1972. – 280 с.

4.2.5. Эккерт Р. и др. Физиология животных. – М.: Мир, 1991. – Т. 1. Фоторецепторы. – С. 239 – 250.

4.2.6. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. – М.: Мир, 1986. – 496 с.

Экспериментальная часть

4.3.1. Инструкция по эксплуатации фотоэлектроколориметра = ФЭКа, модели КФК-2

1. За 15 мин. до начала фотометрии, под контролем лаборанта или преподавателя, дежурный убеждается, что стрелка гальванометра находится в положении «механический 0», открывает крышку кюветного отделения прибора, вставляет его вилку в сетевую розетку и, тумблером на задней панели слева, включает прогрев ФЭКа.

2. Перед началом измерений, вращая рукоять светофильтра, на передней панели прибора слева, установить нужный диапазон светового потока = пучка.

3. Убедиться, что рукоять чувствительности прибора на передней панели справа, соответствует цветовому диапазону рукояти светофильтра.

4. Подготовить фотометрические кюветы нужной толщины, насухо протереть марлевой салфеткой их оптические грани и, убедиться в отсутствии на них пятен и др. грязи. ВНИМАНИЕ! Поскольку каждый ФЭК оснащен лишь одним набором кювет, изготовленных из полированного оптического стекла, пользоваться ими можно лишь над рабочим столом и брать рукой, только за боковые грани, оберегая от царапин и ударов.

5. Убедиться, что стрелка включенного гальванометра находится в положении «электрический 0».

6. Заполнить контрольную кювету дистиллятом или, указанным в соответствующей методике контрольным раствором, убедиться в отсутствии капель и потеков на ее оптических гранях, строго вертикально вставить ее в дальнее гнездо кюветодержателя и, рукояткой в центре передней панели ФЭКа, до упора ввести кювету в световой пучок.

7. В соответствии с п. 6, заполнить вторую кювету исследуемым раствором и вставить ее в свободное гнездо кюветодержателя, примерно на том же расстоянии от источника света. ВНИМАНИЕ! При анализе серии однотипных образцов, избегая излишних промывок кюветы, начинать фотометрию с наиболее разбавленных проб.

8. Закрыть крышку кюветного отделения до звяка шторки и, вращая на передней панели вверху рукояти грубой, а затем и тонкой настройки, установить стрелку гальванометра на 0 шкалы D = А. ВНИМАНИЕ! При положении стрелки между делениями шкалы - округлять цифру до целого значения.

9. Не открывая крышки кюветного отделения, переместить до упора рукоять кюветодержателя в противоположение, заменив тем самым в световом потоке, контрольную кювету исследуемой.

10. Убедиться, что стрелка гальванометра успокоилась и занести показания ФЭКа в протокол опыта.

11. Открыть крышку кюветного отделения, вынуть из кюветодержателя кювету с исследуемым раствором и, декантировать ее содержимое обратно в соответствующую пробирку. ВНИМАНИЕ! Для последующих измерений, во избежание потеков на стенках, кювету не переворачивать, а удерживая вверх дном, осушить ее торец фильтровальной бумагой.

12. При последующих измерениях, руководствоваться пп. 6-11 данной инструкции.

4.3.2. Определение концентрации гемоглобина (Hb) в крови

гемиглобинцианидным методом

Принцип: Основный буферный раствор разрушает эритроциты, а феррицианид калия K₃[Fe(CN)₆] = красная кровяная соль, окисляет до трёхвалентного состояния атом Fe²⁺ гема гемоглобина = Нb. Возникший гемиглобин (Нi), или, по старой номенклатуре - метгемоглобин, реагирует с ацетонциангидрином:

с образованием гемиглобинцианида, имеющего стабильный максимум абсорбции при λ 540-546 нм, пропорциональный содержанию Hb в пробе. Метод общепринят в мировой лабораторной прак-тике, как наилучший по сочетанию параметров. Нормальное содер-жание Нb в крови женщин составляет: 115 – 145 г/л, а мужчин: 132 – 164 г/л. Выпускаемые промышленностью моделигемоглобинометров, обычно основаны на том же принципе фотометрии, но имеют суженный диапазон, соответствующий максимуму А гемиглобинцианида.

Ход определения: В маркированную пробирку внести точно 5 мл трансформирующего раствора, содержащего нужные пропорции буфера, феррицианида калия и ацетонциангидрина. Затем, с помощью полуавтоматического дозатора, туда же добавить 20 мкл крови (Разведение в 251 раз). Полученной смесью многократно промыть наконечник дозатора и тщательно перемешать раствор. Пробирку оставить в штативе не менее чем на 10 мин.

Декантировать пробу в кювету ФЭКа, толщиной 10 мм и при зеленом светофильтре, против трансформирующего раствора, измерить А. Рассчитать концентрацию гемоглобина (г/л) в крови по формуле: А ^.367,7, занести результат в протокол и сделать выводы.

4.3.3. Определение количества эритроцитов в крови с помощью турбидиметрии

Принцип метода: Многократное разведение нативной крови с антикоагулянтом, изоосмотическим раствором с физиологическим рН, делает суспензию эритроцитов относительно стабильной и прозрачной. Это позволяет, при максимально возможной λ ФЭКа, сочетать минимум поглощения энергии света с его максимальным рассеянием, клетками соизмеримого диаметра.

Ход определения:

1. Подготовить в штативе ряд из 7 маркированных пробирок.

2. С помощью мерных пипеток, внести в первую пробирку точно 4 мл, а в остальные – по 2 мл 0,85 % раствора хлорида натрия = физиологический раствор, с рН = 7,36.

3. Полуавтоматическим дозатором на 20 мкл внести в первую пробирку 2 объема (40 мкл) цельной крови. Многократно промыть наконечник дозатора полученной суспензией, тщательно перемешивая ее.

4. С помощью мерной пипетки, перенести из первой пробирки во вторую точно 2 мл суспензии и снова, тщательно ее перемешать.

5. Повторять операцию «переката», перенося точно по 2 мл суспензии и тщательно перемешивая вновь полученную, из второй пробирки в третью, из третьей в четвертую и т.д. Из последней пробирки, 2 мл суспензии слить в отходы.

6. Вращая рукоять на передней панели ФЭКа слева, установить красный светофильтр и, соответственно пп. 2 и 3 работы 4.3.1, убедиться в соответствии положения рукояти его чувствительности на передней панели справа.

7. Начиная с самой разбавленной пробы (пробирка 7) поочередно декантировать содержимое пробирок в кювету толщиной 5 мм и, замерив их абсорбцию против дистиллята или физраствора, занести результаты в таблицу 4.4 протокола опыта.

Таблица 4.4

Анализ серии растворов

8. Рассчитать серии разведений крови, полученных методом «переката».

9. Вычертить график зависимости между разведением проб (абсцисса) и абсорбцией (ордината), определив на нем линейный отрезок разведений, пригодных для счета эритроцитов по степени мутности растворов.

10. Если параллельно, с помощью эталонной микроскопии в камере Горяева, подсчитать содержание эритроцитов в исходном образце крови и разведенных пробах, можно заполнить последнюю строку в таблице 4.4. Соответственно, внеся нужные поправки, удастся построить аналогичный разбавлению калибровочный график, таблицу или простую компьютерную программу, для автоматического счета эритроцитов в разбавленных образцах крови. В частности, так построена калибровочная таблица лаборатории, по которой можно определить содержание эритроцитов в 1 мкл и, соответственно, в 1 л крови исследуемого образца.

11. Сделать выводы из эксперимента, учитывая, что нормальное содержание эритроцитов в крови женщин: 3 – 4,5 ^х 10¹²/л, а мужчин: 4 – 5,5 ^х 10¹²/л.

12. Пара студентов, завершающая фотометрию, оставив открытой крышку кюветного отделения ФЭКа, тумблером на задней панели слева, выключает прибор и вынимает его сетевую вилку из розетки.

13. Слив растворы из кювет, тщательно вымыть их изнутри и снаружи дистиллятом и, оставить вверх дном на фильтре. После чего, убрать рабочее место и сдать его лаборанту.

Вопросы для самоконтроля

4.4.1. Какова природа электромагнитных излучений?

4.4.2. Какие диапазоны спектра электромагнитных излучений вам известны?

4.4.3. Каков принцип построения спектрометров?

4.4.4. В чем заключается важнейший закон физической оптики?

4.4.5. В чем состоит сила теории характеристических спектров?

4.4.6. Объясните границы применимости спектроскопии к объектам химии и биологии.

4.4.7. Что такое «видимый свет» и, как разделяют его диапазоны?

4.4.8. Какому физическому закону подчиняется свет, проходящий через раствор?

4.4.9. Что такое «фотометрический анализ» и, в каких диапазонах он проводится?

4.4.10. Какие разновидности фотометрии вам известны?

4.4.11. Чем различаются спектрофотометрия и колориметрия?

4.4.12. Сформулируйте принципы абсорбционного анализа.

4.4.13. Сформулируйте достоинства и недостатки шкал пропускания и абсорбции.

4.4.14. На какой зависимости основано определение концентрации гемоглобина гемиглобинцианидным методом?

4.4.15. На каких оптических свойствах суспензии разбавленной крови основан фотометрический счет эритроцитов?

4.4.16. Чем объяснить необходимость разбавления крови при подсчете эритроцитов, физиологическим раствором с рН 7,36?

4.4.17. Каковы нормы содержания эритроцитов и гемоглобина в крови человека?

4.4.18. Чем объяснить половой диморфизм концентраций Hb и эритроцитов у людей?

4.4.19. Возможны ли фотометрические измерения концентраций Hb и счета эритроцитов у других видов и классов животных?

Задание на дом

4.5.1. При оформлении протокола и подготовке к занятию 5, исходя из полученных Вами концентраций Hb и эритроцитов и, упростив объём эритроцита человека до цилиндра, диаметром 8 мкм и высотой 1,8 мкм, рассчитайте:

a) объём одного эритроцита;

б) сколько Нb содержится в одном эритроците;

в) сколько молекул Нb входит в один эритроцит, при его молекулярной массе - 64500 Да.

г) какую долю объёма эритроцита занимает Нb, если диаметр молекулы этого глобулярного белка составляет 6,8 нм.

4.5.2. Объясните преимущества биополимеров перед мономерами в реализации биологических функций клетки и важнейших признаков жизни.

4.5.3. Определите понятия «первичная структура» = 1^о и «конформация» полимера.

4.5.4. В соответствии с предложенным шаблоном, создайте на развороте тетради и заполните таблицу характеристик 4-х основных классов биополимеров:

4.5.5. Определите понятие «белок» и расскажите об исторической смене взглядов на их структуру, свойства и функции.

4.5.6. Что Вам известно о размерах, физико-химических свойствах и методах выделения молекул белков?

4.5.7. Какие классификации белков Вам известны?

4.5.8. Что вы знаете о многообразии глобулярных и фибриллярных, простых и сложных белков?

4.5.9. Объясните понятие «кооперативный эффект» на примере мио- и гемоглобина.

4.5.10. Определите понятие «ферменты» и объясните их различия с небиологическими катализаторами.

4.5.11. Как доказать, что доменная организации структуры гомологичных белков служит основой их функций, видовой специфичности и эволюции?

4.5.12. Насколько применимы методы исследований и понятия гидролиз, денатурация и ренативация к небелковым биополимерам?

4.5.13. Как развивались взгляды на принцип комплементарности нуклеиновых кислот, к белок-лигандным и белок-белковым взаимодействиям?