ЗАНЯТИЕ 7. МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА БЕЛКОВ

7.1. Общие замечания.Известно, что белки составляют половину и более сухой массы большинства клеток. Пластичность их полипептидной структуры позволяет белкам играть роль главных «молекулярных машин» в любой клетке и организме. Наконец белки – важнейший источник азота в питании, а, следовательно, росте и развитии консументов. Поэтому определение белка играет первичную = опорную роль во всех количественных исследованиях по энзимологии и биологии клеток, служит основой оценки физиологии и патологии организмов и их популяций, а также – важнейшим критерием оценки качества = эффективности пищевых цепей.

Соответственно задачам и возможностям лабораторий, методы измерения концентрации белков (табл. 7.1) многочисленны и разнообразны. Очевидно, что рефрактометрия (лат. Refractus – преломление) позволяет быстро и просто определять процентные концентрации белка в двухкомпонентных растворах. Гравиметрия – зависит от чувствительности лабораторных весов и требует чистого препарата, высушенного до постоянной массы. Принцип и формула расчета фотометрии белков в УФ, уже приводились в таблице 4.3.

Таблица 7.1

Методы измерения концентрации белков

До 70-х гг. прошлого века, наиболее точным (10^-5 г/л), считалось определение белка по количеству азота. Исходя из того, что в подавляющем большинстве белков, за исключением гистонов и протаминов, содержание азота близко к 16 %, считалось достаточным умножить найденную величину на эмпирический коэффициент 6,25 и, получить содержание белка в препарате. Однако, необходимость минерализации препарата в серной кислоте и последующее определение аммиака, занимали часы-сутки. Из-за длительности и трудоемкости этих процедур, сейчас этот метод применяют редко. По близким причинам, измерение концентраций белка на основе анализа аминокислот, используют лишь в специализированных лабораториях.

С 50-х гг. ХХ в., чаще всего в биохимической литературе цитировали работу Lowry и соавторов, предложивших измерять концентрации белков сочетанием биуретовой реакции с реактивом Фолина-Чиокалто (1927), дающим интенсивную темно-синюю окраску с тирозином, фенилаланином и, меньше с такими аминокислотами, как Три, Гис, Цис. К сожалению, его линейность, сохраняется лишь в узком диапазоне концентраций. Большинство модификаций этой методики сводится к попыткам устранить влияние специфических реагентов, применявшихся при выделении белков. В последние годы появились методы связывания красителей и флуорометрии, если в белке имеется, или, без потери нативных свойств, в него вводится соответствующий маркер. Достоинства и недостатки этих методов сведены в таблицу 7.2.

Таблица 7.2

Сравнение достоинств и недостатков методов измерения количества белка (По Р. Скоупс, 1985 с изменениями)

7.2. Дополнительная литература

7.2.1. Бурштейн Э. А. Люминесценция белковых хромофоров. – М.: ВИНИТИ. Биофизика. Т.6,1976. – 216 с.

7.2.2. Аранович Г. И. и др. Справочник по физико-химическим методам исследования объектов окружающей среды. – Л.: Судостроение, 1979. – 648 с.

7.2.3. Скоупс Р. Методы очистки белков. – М.: Мир, 1985. – С. 310 – 315.

7.2.4. Практикум по биохимии. Под ред. С. Е. Северина и Г. А. Соловьевой. – М.: Изд-во Московского университета, 1989. – С. 80 – 88.

7.2.5. Троицкий Г. В. Дефектные белки. Постсинтетическая модификация. – Киев.: Наукова думка, 1991. – 232 с.

7.2.6. Tиц Н. и др. Руководство по клиническим лабораторным тестам. – М.: Пер. с англ. под ред. В. В. Меньшикова, 1997. – 960 с.

7.2.7. Камышников В. С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. – МЕДПРЕСС-ИНФОРМ, 2004. – 920 с.

Экспериментальная часть

7.3.1. Количественное исследование белковых фракций крови биуретовым методом

Принцип метода:Пептидные группы денатурированных белков образуют в щелочной среде с ионами двухвалентной меди комплексы фиолетового цвета. Как видно из таблицы 7.2, интенсивность окраски пропорциональна количеству пептидных связей в пробах, в широком диапазоне концентраций белка. Однако, фотометрии мешают соли аммония, а йодиды и гликоляты меди, как и медные соли органических кислот, лучше сохраняют реагент и, специфичней к реакции с пептидными связями, чем ее сульфат. Поэтому многочисленные модификации метода различаются добавками в биуретовый реактив: йодида калия (KJ), полиолов (чаще глицерол) или солей ди- и трикарбоновых кислот (реактив Бенедикта).

Внимание! Помнить об агрессивности гидроксида натрия и приготовленного на нем биуретового реактива. В случае попадания их капель в глаза и на кожу, во избежание ожогов, промывать пораженное место проточной водой не менее 15 мин. По возможности нейтрализовать действие щелочи разбавленным (1-2 %) раствором уксусной или борной кислоты.

Ход работы: 1. В соответствии с таблицами 7.3 и 7.4, провести сквозную маркировку 8 пробирок.

2. Получить у лаборанта свои препараты белковых фракций крови, выделенных на предыдущем занятии и поместить их в штатив на рабочем столе.

3. Внести в пробирку с тенями эритроцитов 1 мл. 1н раствора гидроксида натрия, а в пробы с белковыми фракциями плазмы – по 1 мл 0,85% раствора хлорида натрия (физиологического раствора) и, оставить их в штативе, периодически помешивая.

4. В соответствии с таблицей 7.3, пипеткой на 1 мл внести в пробирки 1-5 указанные объемы основного стандартного раствора белка.

Таблица 7.3

Подготовка рабочих стандартных растворов для построения

калибровочного графика концентраций белка

5. Другой пипеткой на 1 мл, довести с помощью физиологического раствора объемы рабочих стандартов до 1мл.

6. В соответствии с таблицей 7.4, полуавтоматическим дозатором на 100 мкл, соответственно меняя наконечники, внести в пробирки 6-8 соответствующие объемы образцов раствора Hb, теней эритроцитов, цельной плазмы крови.

Таблица 7.4

Содержание в крови белковых фракций

7. В каждую из 8 рабочих пробирок внести по 5 мл биуретового реактива.

8. Тщательно перемешать их содержимое и оставить в штативе на 30 мин. для развития окраски.

9. За это время, рассчитать для таблицы 7.3 полученные концентрации рабочих стандартов белка и вычертить соответствующую сетку координат калибровочного графика.

10. За 15 мин. до начала фотометрии, соответственно разделу 4.3.1, дежурный убеждается в исправности ФЭКа КФК-2 и включает его в электросеть для прогрева.

11. Фотометрию всех рабочих растворов проводить в строгом соответствии с разделом 4.3.1, в кювете толщиной 10 мм при зеленом светофильтре (540 – 560 нм), против биуретового реактива, занося значения А рабочих стандартных растворов в таблицу 7.3 протокола занятия.

12. Значения А всех растворов препаратов внести в таблицу 7.4, для

последующих расчетов содержания соответствующих фракций в крови.

13. По данным таблицы 7.3 построить калибровочный график зависимости между величинами абсорбции и концентрациями растворов рабочих стандартов белка.

14. С помощью калибровочного графика определить концентрации белка в растворах фракций крови.

15. При желании, с учетом объема субстратов и добавленных к ним реагентов (Занятие 6), подсчитать разведения фракций и рассчитать их концентрации в исходном образце крови.

Вопросы для самоконтроля

7.4.1. Почему в биохимической практике, количественному определению белка придают первостепенное значение?

7.4.2. Какие физические принципы могут лежать в основе количественного определения белков?

7.4.3. Из каких соображений нужно исходить, выбирая метод количественного определения белка?

7.4.4. На каком принципе основан биуретовый метод определения количества белка в растворах?

7.4.5. Чем объяснить обилие модификаций биуретового метода?

7.4.6. Какие опасности возможны при определении белка биуретовым методом и, как их минимизировать?

7.4.7. Что применяется в биуретовом методе в качестве контрольного образца и почему?

7.4.8. С какой целью и как строят калибровочные графики проб стандартного ряда, в частности, для определения концентраций белка биуретовым методом?

7.4.9. Какими должны быть аминокислотный состав и физико-химические свойства белков цитоплазмы и плазмы крови, чтобы функционировать при физиологическом значении рН = 7,36?

7.4.10. Чем объяснить растворимость большинства белков крови в физрастворе, а то и дистилляте и, необходимость растворения теней эритроцитов в 1н. NaOH?

7.4.11. Что вы знаете о происхождении, структуре, свойствах и функциях СА?

7.4.12. Что вы знаете о происхождении, свойствах и функциях глобулиновых фракций плазмы крови?

7.4.13. Что вы знаете о количественном распределении белковых фракций плазмы крови?

Задание на дом

7.5.1. При оформлении протокола и подготовке к занятию 8 определите понятие «мононуклеотид».

7.5.2. Объясните, чем различаются мононуклеотиды по структуре, свойствам и функциям? Чем объяснить необходимость их номенклатуры и кодирования?

7.5.3. Как возникают 5’-5’ и 5’-3’ фосфодиэфирные связи в ди- и олигонуклеотидах? Какие следствия вытекают из этих различий?

7.5.4. Дайте определение и опишите общие физико-химические свойства полинуклеотидов.

7.5.5. В соответствии с шаблоном, заполните таблицу сравнения

7.5.6. Приведите примеры морфологических структур, являющихся нуклеопротеидами по своему составу. Каковы их функции в клетках?

7.5.7. Организация и эволюция геномов и молекулярно-генетиче-ских систем управления = МГСУ у вирусов, прокариот и эукариот.

7.5.8. Какие методы изучения моно- и полинуклеотидов вам известны?

7.5.9. В чем состоит гибридизация нуклеиновых кислот и, какую роль в геносистематике играет этот метод?

7.5.10. Технологии рекомбинантных ДНК и генномодифицированные организмы.

7.5.11. Роль полимеразной цепной реакции = ПЦР в изучении геномов и диагностике болезней.