ЗАНЯТИЕ 10. РАЗДЕЛЕНИЕ БИОПОЛИМЕРОВ

МЕТОДАМИ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

10.1. Общие замечания.Из курса физической химии известен класс пограничных электрокинетических явлений, свойственных дисперсным системам и капиллярам (рис. 10.1). М. Smoluchowski (1872 – 1917, Польша) объяснил их (1903) возникновением дзета-потенциала, то есть избытка зарядов двойного электрического слоя на границе раздела адсорбционно связанной = неподвижной и тангенциально смещающейся подвижной = диффузионной фазы. Тот же дзета-потенциал, служит и мерой их интенсивности.

Рис. 10.1. Схема группировки пограничных процессов

Очевидно, что электрокинетические явления не только широко распространены в биосфере, но их принципы часто применяют в различных областях техники и медицины. Из них, в аналитической и диагностической биохимии чаще всего используют методы центрифугирования и электрофореза, за разработку которых, соответственно, Т. Svedberg (1926) и A.W.K. Tiselius (1948) из университета в Упсале (Швеция), удостоены Нобелевских премий по химии.

Попытки деления смесей частиц с помощью электрофореза предпринимали с начала ХХ в. В основу их направленной, катодной или анодной подвижности, легли соответственно, отрицательный или положительный знак и целочисленные величины зарядов. К середине века, аппарат Тизелиуса стал основой электрофореза смесей белков. Он состоял из блока питания постоянного тока, стеклянной камеры с электродами, заполненной буферным раствором и довольно сложной оптики для визуальных наблюдений за делением фракций. Таким образом, вторым фактором деления смесей при свободном электрофорезе в растворе, стали величины рН и ионной силы буфера, изменяющие степень ионизации белков. Так, выбор стандартного рН 8,6 буферного раствора для белков сыворотки крови вызван тем, что в этом случае, все их фракции имеют катодную подвижность. К сожалению, приборы этой конструкции, имели ряд неустранимых недостатков, начиная с хрупкости и низкой разрешающей способности и, кончая высокой стоимостью.

В 1950 г. Durrum et al. предложили вести электрофорез белков сыворотки крови на полосках фильтровальной бумаги, пропитанных буфером. Этот тип электрофореза назвали зональным или зонным, т.к. поддержка среды-носителя ограничила диффузию компонентов смеси. Таким образом, свойства зоны, в качестве которой применяют хроматографическую бумагу, ацетилцеллюлозу, водные гели крахмала, агарозы и полиакриламида = ПАГ, стали третьим фактором деления смесей линейных биополимеров. Наконец, замена: стекла на пластиковые камеры разных конструкций и оптических систем прямого наблюдения на сравнительно простые вспомогательные приемы, резко удешевили конструкцию приборов, стандартизовав основные процедуры метода. (рис. 10.2).

Рис. 10.2. Результаты зонного электрофореза нормальной сыворотки крови человека. (По http://immunologia.narod.ru/pic20.1.htm).

На электрофореграмме (внизу) и ден-ситограмме (вверху) видны 5 основных полос и пиков, соответствующих сывороточному альбумину = СА и фракциям глобулинов.

Таким образом, любой современный прибор для зонного электрофореза, как минимум включает в себя блок питания постоянного тока, обычно до 500 В и электрофоретическую камеру принципиально разных конструкций, зависящих от свойств зоны и выбора горизонтального, вертикального или других вариантов метода. До сих пор справедливо утверждение, что электрофорез – в основном аналитический метод. Тем не менее, его тонкие модификации, подобные электрофорезу в гелях, изотахофорезу и изоэлектрофокусированию, удается применить и к целям получения препаратов (Скоупс, 1985). Однако автор предупреждал, что пока не освоены простейшие методики зонного электрофореза, начинающим исследователям не стоит и помышлять об этих изощренных процедурах, связанных с множеством трудностей.

10.2. Дополнительная литература

10.2.1. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. – М.: Наука, 1981. – 286 с.

10.2.2. Остерман Л. А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. – М.: Наука, 1983. – 304 с.

10.2.3. Скоупс Р. Методы очистки белков. – М.: «Мир». 1985. – 358 с.

10.2.4. Троицкий Г. В. Дефектные белки. Постсинтетическая модификация. – Киев.: Наукова думка, 1991. – 232 с.

10.2.5. Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение. – М.: Мир, 1986. – 398 с.

10.2.6. http://www.cultinfo.ru/fulltext/1/001/008/126/016.htm

Принципы метода: 1. Подача напряжения на электроды камеры, в которой горизонтально размещены полоски хроматографической бумаги или ацетилцеллюлозы, пропитанные буферным раствором рН 8,6, приводит в состояние направленного движения, как ионы буфера, так и молекулы нанесенной на полоски смеси белков, заряд которых отчасти первичен = собственный, а частично наведен действием буфера.

2. Процесс зонного электрофореза характеризуют двумя величинами: 1) градиентом потенциала – В/см расстояния между электродами и 2) плотностью тока – мА/см поперечного сечения проводников. Понятно, что для стандартизации условий в камере, эти величины должны быть const. Напротив, при сравнении результатов полученных в разных камерах, оба электрических параметра нужно приводить к одинаковым величинам.

3. В зависимости от величин градиента потенциала различают низко- (5-15), средне- (20-40) и высоковольтный (> 50) электрофорез. В повседневной практике большинства диагностических лабораторий применяют первый из них. Поэтому правила работы с прибором для электрофореза аналогичны обращению с бытовыми электроприборами. Однако, нужно учитывать, что рост напряжения, автоматически ведет к нагреву системы и чреват ростом диффузии и возможностью денатурации белков! Поэтому, прежде чем повышать градиент потенциала, нужно позаботиться об эффективном охлаждении содержимого камеры.

4. Расчет плотности тока проверяют с помощью миллиамперметра, т.к. при постоянных напряжении и суммарном сечении зоны, он, по закону Ома, устанавливается автоматически.

5. Ацетилцеллюлозную пленку в качестве носителя = зоны, предложил Kohn (1958). При этом сохранилась разрешающая способность метода, а главным преимуществом, по сравнению с хроматографической бумагой, стала большая гидрофобность ацетилированной целлюлозы. Она существенно снизила сорбцию белков зоной, что позволило сократить расход сыворотки на полосу с 20-100 мкл до 1-3 мкл, уменьшить время анализа с 18 ч до 60-90 мин и, наконец, избавиться от «хвостов», снизив размывание фракций. Однако большая гидрофобность ацетилцеллюлозы резко замедляет фильтрацию в ней буфера и существенно ухудшает механическую прочность носителя.

6. Положение белковых фракций в зоне определяют после электрофореза, путем их фиксации и последующей окраски, обычно раствором бромфенолового синего, амидошварца, кумасси синего и др.

7. Так как белки сорбируют разные количества красителя, то их содержание во фракциях можно оценить лишь ориентировочно. Для этого пятна вырезают из зоны, размещают в отдельные пробирки, экстрагируют из них краситель разбавленным раствором едкого натра, после чего проводят фотометрию экстрактов. Гораздо удобней в тех же целях применять денситометр, в котором зоны сканируют через оптопару в постоянном режиме.

Ход работы: 1. Положить на чистый лист лабораторной тетради ацетилцеллюлозную плёнку, матовой поверхностью вверх.

2. Простым карандашом, нанести с одного из концов свой номер, тип образца и, отступив от края 5 см – линию старта, с учетом того что графит, препятствует растеканию водных растворов!

3. Открыть крышку камеры прибора для горизонтального электрофореза ПЭФА-1 и убедиться, что уровень буфера в электродных сосудах одинаков. В противном случае, долить свежий буфер до примерно одного уровня.

4. Пропитать ленку буферным раствором, уложить ее середину на решетку камеры, проследив, чтобы линия старта для белковых фракций плазмы (сыворотки) или раствора Hb, находилась со стороны анода, а для белков теней эритроцитов – с катода.

5. Поочередно и аккуратно опустить концы пленки в электродные сосуды, следя чтобы: 1) ее середина, по возможности не провисала; 2) длинная ось пленки шла в пределах пластиковых границ решетки; 3) края соседних плёнок не соприкасались друг с другом; 4) оба конца пленки погрузились в буферный раствор.

6. Убедившись, что все 8 дорожек камеры заняты пленками и, ожидая, пока последние пропитаются буферным раствором, получить у лаборанта свои образцы белковых фракций крови, выделенных на занятии 6.

7. Убедившись, что все 8 зон пропитаны буферным раствором, ребром покровного стекла или наконечником дозатора, нанести на линии старта образцы белковых фракций.

8. Плотно закрыть камеру крышкой, во избежание испарения буферного раствора. Внимание! Операции 9-20 требуютсоблюдения правил электробезопасности.

9. Убедиться в исправности токонесущих проводов и, вставив их разъем в узел камеры, соединить ее с блоком питания.

10. Убедившись в исправности заземления блока питания и его кабеля, вставить вилку в сетевую розетку. В случае обнаружения каких-либо неисправностей, немедленно доложить о них преподавателю или лаборанту.

11. Клавишей на передней панели блока питания включить прибор в сеть и убедиться, что высвечен индикатор напряжения.

12. Рукояткой потенциометра установить напряжение около 150 В и, переведя среднюю рукоятку передней панели вправо, убедиться, что на 1 см сечения плёнки приходится ток в 1 мА.

13. Вернуть рукоятку в прежнее положение и оставить систему для электрофореза на 60-90 мин, периодически отслеживая ее состояние.

14. За 5-10 мин до окончания электрофореза убедиться, что сушильный шкаф включен и температура в нем близка к 100 С.

15. По истечении срока электрофореза, один из дежурных студентов приносит к прибору горячую решетку сушильного шкафа, а другой тем временем, клавишей на передней панели блока питания выключает прибор и вынимает сетевую вилку из розетки.

16. Отсоединить камеру от токонесущих проводов блока питания и снять с нее крышку.

17. С помощью двух стеклянных палочек, поочередно извлечь из камеры ацетилцеллюлозные плёнки, аккуратно укладывая их на специальный дырчатый планшет.

18. Подсушить пленки на воздухе под тягой, затем перенести их в сушильный шкаф и фиксировать белки при 105 С, примерно 10-15 мин.

19. Один из дежурных студентов, взяв в вытяжном шкафу пластиковую кювету для окраски пленок, подносит ее к сушильному шкафу.

20. Другой дежурный, тем временем, вынимает из сушильного шкафа высохшие пленки и укладывает их в кювету, после чего выключает шкаф.

21. Вернуть кювету с пленками в вытяжной шкаф для органики.

22. Поочередно придерживая пленки стеклянной палочкой, аккуратно залить их из склянки раствором красителя для электрофореза (амидочерный 10 Б). Остающиеся под пленками пузырьки воздуха, по возможности удалить с помощью стеклянных палочек.

23. Через 5-10 минут, слить из кюветы избыток красителя через воронку, в склянку для его хранения и повторного использования.

24. Залить плёнки в кювете отмывающим раствором (3 % уксусная кислота), покачивая ее 5-10 мин, по возможности отмыть пленки от избытка красителя и, слить раствор из кюветы в приемник для отходов.

25. Повторить процедуру 2-3 раза, пока смыв станет почти бесцветным.

26. Высушить плёнки на воздухе или под вентилятором.

27. В соответствии с рис. 10.2, самое интенсивное пятно с наибольшей катодной подвижностью, идентифицировать как фракцию сывороточного альбумина = СА.

28. Приняв электрофоретическую подвижность СА за 1, по аналогии с величинами Rf (занятие 8), рассчитать подвижности остальных фракций белков плазмы.

29. В соответствии с подвижностью идентифицировать белковые фракции и, промаркировав их буквами греческого алфавита в порядке убывания зарядов, занести результаты в протокол занятия.

30. Сравнить картину результатов электрофореза с нефелометрической оценкой высаливания фракций белков плазмы (Работа 6.3.3.).

Вопросы для самоконтроля

10.4.1. Что такое электрокинетические явления, где они встречаются и чем измерить их интенсивность?

10.4.2. Какие типы электрокинетических явлений Вам известны и какова их роль в биологии и технике?

10.4.3. Определите понятие «электрофорез» и перечислите основные факторы деления смесей при свободном электрофорезе.

10.4.4. Определите направление миграции аспарагиновой кислоты при pH 1 и pH 7; дипептида Глу-Гис при pH 1 и pH 10.

10.4.5. При каких значениях pH легче разделить с помощью электрофореза дипептиды Гли-Лиз, Асп-Вал и Ала-Гис?

10.4.6. Учитывая, что изоэлектрические точки тропомиозина, гемоглобина и рибонуклеазы, соответственно лежат при значениях pH 5,1, 6,8 и 9,45, укажите направление их смещения и относительную подвижность при электрофорезе в буферах с pH 4,2; 4,8; 5,1; 9,5 и 11,8.

10.4.7. Какую электрофоретическую подвижность имеют белки плазмы при рН 8,6?

10.4.8. В чем преимущества зонного электрофореза перед свободным и как их можно использовать в условиях лабораторий?

10.4.9. Какими электрическими величинами характеризуют процесс зонного электрофореза?

10.4.10. Какие разновидности электрофореза в зоне Вам известны и в чем заключаются их преимущества и недостатки?

10.4.11. Что вы знаете об устройстве приборов для электрофореза?

10.4.12. Что вы знаете о денситометрии электрофореграмм?

10.4.13. Как фиксируют и выявляют белковые фракции на электрофореграммах?

10.4.14. Как рассчитать относительную подвижность белковых фракций на электрофореграммах?

Задание на дом

10.5.1. При оформлении протокола и подготовке к Занятию 11, объясните понятие «стехиометрия реакций».

10.5.2. Вспомните, что вы знает о катализе и, обратном ему явлении ингибирования химических реакций и процессов?

10.5.3.Какие механизмы катализа Вам известны?

10.5.4. Определите понятие окислительно-восстановительный процесс и расскажите об их основных типах.

10.5.5. Чем, по Вашему мнению, занимается энзимология?

10.5.6. Сформулируйте понятие «Биологическое окисление» и расскажите о его механизмах и функциях, указав роли важнейших подклассов оксидоредуктаз: цитохромов, анаэробных и аэробных дегидрогеназ, оксидаз.

10.5.7. Что Вы знаете о микросомальном окислении и его функциях? Дайте краткую характеристику моно- идиоксигеназ.

10.5.8. Расскажите об образовании активных форм кислорода =АФК и механизмах их повреждающего действия.

10.5.9. Что Вы знаете о составе и функциях систем антиоксидантной защиты?

10.5.10. С позиций термодинамики открытых систем, объясните термин «метаболизм» и объясните его двойственную природу.

10.5.11. Что вы знаете об энд- и экзергонических реакциях и роли макроэргических соединений?

10.5.12. Что вам известно о внеклеточной, анаэробной и аэробной стадиях катаболизма и соответствующих фазах анаболизма?

10.5.13. Расскажите о химическом составе и функциях пищеварительных соков.

10.5.14. Какую роль играют сдвиги рН в различных отделах пищеварительного тракта и, каковы механизмы секреции в нем ионов и ферментов?

10.5.15. На примере протеиназ пищеварительного тракта и свертывающей системы крови, объясните смысл существования ферментных каскадов.