ЗАНЯТИЕ 5. СЕМИНАР. ПРОБЛЕМЫ БИОПОЭЗА И

СТАТИЧЕСКОЙ БИОХИМИИ

5.1. Общие замечания.Занятие, как обычно, начинается с проверки СРС и разбора неясностей. Затем, в течение часа студенты письменно отвечают на 3 из рассмотренных вопросов учебной программы о структуре, свойствах и функциях воды и биомолекул, свойствах и классификациях растворов, гипотезах зарождения жизни.

Темы реферативных сообщений

см. стр. 10-13 данного пособия.

Обсуждение рефератов

Задания на дом

5.4.1. При оформлении протокола и подготовке к занятию 6 объясните, какие типы биохимического анализа вам известны и, в чем различия между ними?

5.4.2. Сформулируйте требования к изъятию, транспортировке в лабораторию и хранению биоматериалов для их последующего химического анализа.

5.4.3. Чем различаются цели и приемы препаративной и аналитической биохимии?

5.4.4. На каких принципах основано извлечение биомолекул и клеток из структуры тканей?

5.4.5. Объясните, что такое дифферон, и к каким биообъектам применимо это понятие?

5.4.6. Объясните термины «озоление», «сушка», «гомогенизация», «экстракция», «флотация» и «седиментация». Когда и зачем их применяют в биохимии?

5.4.7. Как удалить белки из раствора?

5.4.8. Объясните понятие «антикоагулянты» и приведите их примеры.

5.4.9. Какие методы концентрирования растворов вам известны и, зачем их применяют?

5.4.10. Что такое «высаливание» и зачем оно применяется?

5.4.11. Объясните термин «хроматография» и приведите известные Вам примеры применения этого метода.

5.4.12. Определите понятие «электрофорез» и объясните, зачем применяют этот метод?

5.4.13. Объясните термин «гемолиз» и назовите известные вам его разновидности.

5.4.14. Объясните различия понятий «плазма» и «сыворотка» крови.

5.4.15. Объясните термин «гематокрит» и его диагностическое значение.

5.4.16. В соответствии с предложенным шаблоном, заполните таблицу известными вам физическими характеристиками форменных элементов крови млекопитающих:

5.4.17. Схему к занятию 6, дополните необходимыми терминами:

ЗАНЯТИЕ 6. ОСНОВНЫЕ ПРИЕМЫ ПРЕПАРАТИВНОЙ

БИОХИМИИ

6.1. Общие замечания. Известно, что все организмы состоят, из клеток и продукта их жизнедеятельности = внеклеточного вещества. Причем прокариоты, простейшие и грибы, встречаются в виде отдельных клеток или их колоний. Многоклеточные же эукариоты, типа высших растений и животных, обычно состоят из множеств клеточных дифферонов, структурно сопряженных друг с другом в ткани, согласованные в своем метаболизме и жизненных циклах в интересах организмов, их популяций и сообществ. Залог успеха разрушающего биохимического анализа – рациональный выбор биообъекта, щадящие и верные приемы изъятия из организма образца ткани, его фиксации, хранения и обработки. Различия же в целях и методах анализа (рис. 6.1) проявились к началу ХХ в.

Рис. 6.1. Схема целей и этапов биохимических исследований

Изучение структуры и функций биомолекул потребовало их выделения и очистки до минимума примесей, а в идеале – до однородного состояния. Но быстрота разрушения части молекул, например, с функцией медиаторов, как и высокая вероятность денатурации белков, часто вынуждают хранить и вести выделение препаратовна холоде. Для извлечения = экстракции большинства белков из клеток животных, обычно достаточно механической гомогенизации в водной среде выделения. Разрушение же клеточных стенок растений и, особенно микроорганизмов, требует шаровых мельниц, ультразвука и других жестких приемов. Удаление из гомогенатов обрывков волокон, фрагментов клеточных структур и т.п., ведут с помощью их отстаивания, фильтрации или центрифугирования, а для удаления или замены низкомолекулярных веществ, пользуются диализом,ультрафильтрацией или молекулярными ситами. Трудоемкость процедур препаративной биохимии и обилие специфических терминов поясняет схема (рис. 6.2).

Рис. 6.2. Схема методов препаративной биохимии

Очевидно, что процесс выделения и очистки препарата почти неизбежно связан с его разбавлением, требующим потом, адекватного задаче концентрирования раствора. Часто для этого применяют высаливание белков, то есть их осаждение из раствора с помощью больших концентраций нейтральных солей: NaCl, (NH₄)₂SO₄, MgSO₄ и т.д., в соответствии с положением ионов в ряду Гофмейстера. Этот прием основан на: 1) нейтрализации зарядов молекул белка с помощью противоионов и 2) обратимом разрушении их гидратных оболочек. Т.к. высаливание зависит от размеров и гидрофобности макромолекул, то глобулины плазмы крови оседают при 50 % концентрации сульфата аммония, а осаждение сывороточного альбумина = СА, требует его 100 % насыщения. Т.о., высаливание позволяет не только концентрировать целевой продукт, но и обеспечивает его дополнительную очистку. Осадки белков после этого, растворяют добавлением воды или повторным диализом, добиваясь 50-80 % концентрации препарата. Такой продукт называют сырцом и подвергают заключительным этапам очистки и проверки гомогенности, с помощью разных вариантов хроматографии и электрофореза.

Для диагностики состояний животных и людей, физиологи и врачи неоднократно пытались применять доступные покровные ткани, секреты и экскреты, но быстро убеждались в их ограниченной информативности. Поэтому, уже свыше 100 лет, основным источником информации служит химический анализ слюны, желудочного сока, желчи, молока и, особенно крови, получаемых с помощью малоболезненных и относительно простых и безопасных процедур. Понятно, что точность основных аналитических процедур, уже рассмотренных на предыдущих занятиях, зависит от правильного взятия проб, например, крови – натощак и т.д. и точного выполнения приемов хранения и подготовки материалов к анализу, в основном совпадающих с вышеописанными методами препаративной биохимии.

К сожалению, большинство диагностических лабораторий РФ, как и 100 лет назад, ведет эти анализы вручную, трудоемкими методами микроскопии и классической биохимии. Поэтому, относительно точные = эталонные результаты диагностических показателей выдаются через часы или сутки, а на их получение, идет свыше трети трудозатрат соответствующих лабораторий. Тем не менее, именно они дают от 80 до 100 % объективной и полезной информации о молекулярно-клеточном состоянии и системах управления внутренней средой организма.

6.2. Дополнительная литература

6.2.1. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. – М.: Мир, 1980. – С. 154 –170, 247 – 382.

6.2.2. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. – М.: Наука, 1981. – 285 с.

6.2.3. Скоупс Р. Методы очистки белков. – М.: Мир, 1985. – 358с.

6.2.4. Геккелер К., Х. Экштайн Аналитические и препаративные лабораторные методы. – М.: Химия, 1994. – 416 с.

6.2.5. Цыганенко А. Я. и др. Клиническая биохимия. – М.: Триада-Х, 2002. – 504 с.

6.2.6. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. – М.: Мир, 2002. – 589 с.

Экспериментальная часть

Проводится в соответствии со схемой на рис. 6.3:

Рис. 6.3. Схема деления крови на фракции (пояснения в тексте)

6.3.1. Деление плазмы и форменных элементов крови = ФЭК

1. В маркированную центрифужную пробирку внести 1-2 мл крови с добавкой антикоагулянта: 0,5 % гепарина; 0,2-0,5 % Трилона Б = динатриевой соли этилендиаминотетраацетата = ЭДТАNa₂ и т.п.

2. Зафиксировав в протоколе занятия исходный объем крови, поместить пару пластиковых гильз центрифуги на чашки центрифужных весов и вставить в них пробирки с кровью.

3. Определить, какая чашка легче и, в ее гильзу, но не пробирку, добавить для уравновешивания из пипетки по каплям дистиллят. ВНИМАНИЕ! Во избежание повторения процедуры с другой чашкой, опасаться передозировки!

4. Уравновесив гильзы с пробирками, установить их в противоположные по диаметру гнезда ротора центрифуги ОПН-3.

5. Дежурный студент, убедившись, что на задней панели центрифуги переключатель скорости вращения находится в положении 2 – 2000 об/мин и, дождавшись повторения пп. 2-4 всей подгруппой, закрывает прибор крышкой и, вставив его вилку в сетевую розетку, клавишей на передней панели включает вращение ротора. Затем, повернув по часовой стрелке рычаг на циферблате таймера, устанавливает время – 10 мин., убедившись по звуку, что он действует.

6. По звонку таймера, клавишей на передней панели центрифуги – отключить прибор.

7. Дождавшись полной остановки ротора и, сняв затем крышку центрифуги, осторожно, чтоб не взмутить рыхлый осадок ФЭК, перенести свою пробирку из гильзы в штатив на столе. При наличии воды в гильзе – выплеснуть ее в раковину водопровода.

8. С помощью полуавтоматического дозатора или пипетки с грушей, аккуратно отсосать из центрифужной пробирки по возможности весь надосадок, перенося чистую плазму крови в новую маркированную пробирку для выполнения работы 6.3.3.

9. Зафиксировав в протоколе занятия полученные объемы плазмы и эритроцитов, осторожно, чтобы не вызвать гемолиза, к осадку последних добавить 2-3 мл физиологического раствора, суспендировать его и повторить операции пп. 2-7.

10. Слив надосадок в раковину водопровода, использовать однократно промытый осадок ФЭК в работе 6.3.2.

6.3.2. Разделение гемоглобина и теней эритроцитов

1. Добавить к осадку ФЭК 2 объема дистиллята и 1 каплю хлороформа для ускорения осмотического гемолиза.

2. Закрыв горло пробирки пробкой, обернутой полиэтиленовой пленкой или алюминиевой фольгой, энергично встряхнуть ее содержимое и поставить пробирку в штатив на 30 мин., периодически встряхивая для ускорения полноты гемолиза.

3. Уравновесив пробирки на центрифужных весах аналогично пп. 2-7 работы 6.3.1, центрифугировать гемолизаты 20 мин. при 2000 об/мин.

4. Красный надосадок водного раствора гемоглобина количественно перенести в чистую, четко промаркированную пробирку и, закрыв ее пробкой, сдать на хранение в холодильнике лаборанту, для работ на следующих занятиях.

5. Перевернув пробирку вверх дном, подсушить плотный белесый осадок на фильтровальной бумаге.

6. Аналогично п. 4 данной работы, четко маркировать пробирку и, закрыв ее пробкой, сдать на хранение лаборанту, как препарат теней (уст. – стромы) эритроцитов. При желании, небольшую часть материала стоит микроскопировать с большим увеличением.

6.3.3. Высаливание белковых фракций плазмы крови и их

количественная нефелометрия

Основаны на способности белков, в зависимости от прочности их гидратных оболочек, оседать из раствора при определенных концентрациях фосфатных солей. Степень помутнения растворов, определенная нефелометрией на ФЭКе КФК-2, пропорциональна содержанию белка в соответствующей фракции.

1л основного фосфатного буферного раствора содержит: 67 г. NaOH и 463,6 г. К₃РО₄. Соотношение объемов рабочих буферных растворов – в таблице 6.1.

Таблица 6.1

Состав рабочих буферных растворов.

1. В соответствии с таблицей 6.2 поместить в 6 пронумерованных центрифужных пробирок:

Таблица 6.2.

Состав проб, мл для высаливания белковых фракций плазмы

2. Пробы тщательно перемешать и, точно через 15 мин с момента добавки препаратов, измерить величины А растворов на ФЭКе с красным светофильтром, в кювете толщиной 5 мм против контроля. 3. Убедившись в надежной маркировке проб, плотно закрыть их пробками и сдать образца на хранение лаборанту для работы на следующих занятиях.

4. Для каждой фракции белков плазмы рассчитать истинное значение А по формулам: Сывороточный альбумин = СА = А3 - А4;

α–глобулины = А4 - А5;

β–глобулины = А5 - А6;

γ–глобулины = А6.

5. Полученные истинные значения А для всех фракций суммировать и, приняв найденную величину за 100 %, рассчитать по формуле:

В норме, плазма крови млекопитающих содержит 60-80 г/л белка, из которых 35-50 г/л СА и 25-30 г/л глобулинов. Т.е. отношение альбумина к глобулинам = индекс А/Г лежит в пределах 1,5-2,3. Отсюда, относительное содержание CА в плазме крови составляет 55%, α–глобулинов – 10-18%, β–глобулинов – 8-14% и γ – глобулинов – 12-22%. Данные величины, как важнейшие константы гомеостаза, изменяются лишь при тяжелых кровопотерях, воспалительных и инфекционных заболеваниях и, крайней степени белкового голодания – маразме.

Вопросы для самоконтроля

6.4.1. С позиций биологии, определите понятие «ткань».

6.4.2. Какие разновидности биотканей вам известны?

6.4.3. Определите понятие «дифферон» и приведите их примеры.

6.4.4. Можно ли биохимические методы анализа назвать неразрушающими?

6.4.5. Чем различаются основные подходы к биохимическому анализу и в чем состоит залог его успеха?

6.4.6. В чем могут заключаться подготовительные операции при биохимическом анализе?

6.4.7. В каком температурном режиме хранят материал и выделяют биохимические препараты?

6.4.8. Почему нет единого алгоритма для выделения биомолекул?

6.4.9. Сформулируйте основные этапы препаративной биохимии.

6.4.10. Назовите основные этапы диагностической биохимии.

6.4.11. Какие способы разрушения тканей и клеток вам известны?

6.4.12. Почему ткани животных разрушать проще, чем клетки прокариот и ткани растений?

6.4.13. Какими приемами удаляют из гомогенатов недостаточно разрушенный материал?

6.4.14. Какие принципы могут лежать в основе разделения смеси биомолекул?

6.4.15. Какие факторы нужно учитывать при экстракции или осаждении биополимеров из смеси?

6.4.16. Что такое «высаливание» и зачем оно применяется?

6.4.17. Какие методы применимы для удаления или замены низкомолекулярных веществ в гомогенатах?

6.4.18. Что такое «молекулярные сита» и на каком принципе основано их применение? Назовите синонимы этого метода?

6.4.19. Почему различия в фазовых переходах сравнительно редко применяются к разделению биомолекул?

6.4.20. Какие методы разделения макромолекул основаны на разнице в их размерах?

6.4.21. Что такое хроматография и, какие ее разновидности вам известны?

6.4.22. Что такое «изоэлектрическая точка» и чем она отличается от понятия «изоэлектрическое состояние»?

6.4.23. Что вы знаете об электрофорезе и, чем он отличается от изоэлектрофокусирования?

6.4.24. Какие способы концентрирования растворов вам известны?

6.4.25. Как убедиться в гомогенности и нативных свойствах препарата?

Задания на дом

6.5.1. При оформлении протокола и подготовке к занятию 7 объясните, почему основным источником информации для диагностики состояний животных и людей, чаще всего служит кровь? В чем вы видите недостатки и достоинства ее применения?

6.5.2. Объясните понятие «гематокрит» и его диагностические возможности.

6.5.3. Чем объяснить легкость выделения из крови эритроцитов и сложность выделения прочих форменных элементов?

6.5.4. Чем объяснить разницу выделенных объемов гемоглобина и «теней» эритроцитов?

6.5.6. Что вы знаете о происхождении и функциях белков плазмы крови?

6.5.7. Чем различаются понятия «плазма» и «сыворотка» крови?

6.5.8. В соответствии со схемой 6-3, рассчитайте для каждого этапа затраты материала и его разведение. Обдумайте, насколько целесообразна подобная схематизация для предстоящих работ?

6.5.9. Исходя из молекулярной массы триптофана – 204 Да и его содержания в СА – 0,58%, рассчитайте минимальную массу бычьего сывороточного альбумина = БСА.

6.5.10. В соответствии с предложенным шаблоном, заполните таблицу, отразив известные вам сферы деятельности человека, связанные с методами определения количества белка:

6.5.11. Чем отличаются ферменты = энзимы = Е от небиологических катализаторов?

6.5.12. Какими методами изучают Е и, как измеряют их активность?

6.5.13. Что такое специфичность действия Е и в чем заключаются стадии биокатализа?

6.5.14. Что вы знаете о номенклатуре Е?

6.5.15. Попытайтесь суммировать роль ионов металлов и витаминов для биокатализа.

6.5.16. Объясните принцип действия конкурентных ингибиторов Е и степень их обратимости.