Работа 2. Подсчет форменных элементов крови

Количество форменных элементов в крови имеет большое значение для нормального состояния организма. Определение их количества производят под микроскопом, используя специальные счетные камеры. Подсчет производят в 1 мм³ (мкл) крови, для чего пробу крови разбавляют в специальных смесителях (меланжерах), чтобы создать нужную концентрацию клеток, удобную для подсчета.

Цель работы. Определить количество форменных элементов (эритроцитов и лейкоцитов) в исследуемой пробе крови.

Материалы и оборудование: Счетная камера Горяева (рис. 3) представляет собой толстое предметное стекло, в средней части которого имеются четыре желобка. Между ними образуются узкие площадки. Средняя площадка ниже боковых на 0,1 мм и разделена пополам поперечным желобком (канавкой). По обе стороны от этого желобка расположены сетки, нанесенные на стекло. При наложении на боковые площадки покровного стекла над сеткой образуется камера глубиной 0,1 мм. Сетка Горяева (рис 4.) состоит из 225 больших квадратов.

Рис. 3. Камера Горяева (внешний вид)

Каждый третий квадрат разделен на 16 малых квадратов. Таких больших квадратов, разделенных на маленькие, в сетке 25. Сторона малого квадрата равняется 1/20 мм, площадь – 1/400 мм², а объем пространства над малым квадратом равен 1/400 мм² ´ 1/10 мм = 1/4000 мм³ (мкл). Сторона большого квадрата равняется 1/5 мм, площадь – 1/25 мм², а объем пространства над квадратом равен 1/25 мм² ´ 1/10 мм = 1/250 мм³ (мкл). Длина стороны всей сетки составляет 3 мм, площадь – 9 мм², объем ­0,9 мм³ (мкл).

Знакомимся с устройством счетной камеры и сеткой, поместив ее под микроскоп и рассмотрев на малом (объектив ´10) и большом (объектив ´40) увеличениях.

Рис. 4. Сетка камеры Горяева

Смеситель представляет собой пипетку с ампулообразным расширением (рис. 5). В ампуле находится стеклянная бусинка для лучшего размешивания крови. На капилляре нанесены две метки: «0,5» и «1,0»; третья метка стоит за ампулообразным расширением: на смесителе для эритроцитов – «101», для лейкоцитов – «11». Если в смеситель для эритроцитов набирают кровь до метки «1,0», а затем наливают разбавляющую жидкость, доводя общий объем до «101», кровь разводится в 100 раз.

Рис. 5. Смесители для эритроцитов (а) и лейкоцитов (б)

При разведении в 200 раз кровь следует набирать в смеситель до метки «0,5». Аналогично в смесителе для лейкоцитов получают разбавление крови в 10 и 20 раз.

Для разбавления крови при подсчете эритроцитов применяют гипертонический раствор NaCl (3 %), в котором эритроциты сморщиваются. При подсчете лейкоцитов применяют 5 % раствор уксусной кислоты, подкрашенной метиленовой синью. Кислота разрушает оболочки эритроцитов и лейкоцитов, а метиленовая синь окрашивает ядра последних. При этом эритроциты становятся невидимыми и не мешают подсчету лейкоцитов.

Зарисовываем смесители для эритроцитов и лейкоцитов. Обозначаем их составные части и метки.

Ход работы. При помощи груши, соединенной гибким резиновым шлангом со смесителем для эритроцитов, набираем кровь в его капилляр до метки «0,5» (следим, чтобы не попали пузырьки воздуха). Вытираем конец капилляра фильтровальной бумагой и быстро переносим его в раствор для разведения крови. Набираем раствор до метки «101». После этого смеситель переводим в горизонтальное положение и кладем на стол. Аналогичным образом заполняем и смеситель для лейкоцитов (кровь до метки «0,5», раствор до метки «11»).

Сетку камеры плотно закрываем покровным стеклом, притерев последнее до появления цветных колец (кольца Ньютона), что служит показателем того, что стекла прилегают вплотную. Для этого камеру перед работой тщательно моют водой, вытирают насухо; так же подготавливают шлифо­ванное покровное стекло. Камеру Горяева берут в руку. На участок камеры, где нанесена сетка, ук­ладывают шлифованное покровное стекло. Затем стекло берут и другой рукой. При этом нижняя по­верхность камеры находится на двух средних пальцах, два указательных пальца придерживают ее спереди. Свободными двумя большими пальцами притирают шлифованное покровное стекло, плав­но продвигая его по поверхности прямоугольных стеклянных пластинок до появления цветных колец Ньютона в местах плотного прилегания (притирания) покровного стекла к поверхности прямоугольных пластинок камеры (это свидетель­ствует о высоте камеры в 0,1 мм).

Сняв резиновую трубку со смесителя и зажав пальцами оба конца встряхиваем его в течение минуты. Выдуваем три капли из смесителя на вату, нанося четвертую на среднюю пластинку камеры у края покровного стекла. Капля заполняет камеру благодаря капиллярным силам. Обычно одну из сеток заполняют для подсчета эрит­роцитов, другую – для подсчета лейкоцитов. Излишек раствора при этом стекает в желобки. Если на сетку попал воздух, то камеру следует промыть дистиллированной водой, насухо вытереть и заполнить снова. Заполненную камеру оставляем в горизонтальном положении на 1 мин (для оседания форменных элементов на ее дно), а затем, не меняя ее положения, ставим под микроскоп, и если форменные элементы расположены равномерно, приступаем к подсчету. Считать удобно на малом увеличении.

В последнее время, для разведения исследуемой пробы крови вместо смесителей используют обычные пробирки, наполненные разводящей жидкостью (4 мл при подсчете эритроцитов и 0,4 мл при подсчете лейкоцитов). Пробу крови (объемом 0,02 мл) забирают стандартной пипеткой. Затем пробу крови выдувают на дно пробирки с разводящей жидкостью, а пипетку промывают верхним слоем жидкости, повторно набирая и выдувая ее в пробирку. Итоговое разведение, в результате, составит 200 раз при подсчете эритроцитов и 20 раз при подсчете лейкоцитов. Содержимое пробирки перемешивают и оставляют до исследования. При этом форменные элементы рекоменду­ется считать с помощью камеры Горяева не позд­нее 3-х часов после взятия пробы. Перед заполнением камеры разведенной кровью, необходимо предвари­тельно несколько раз встряхнуть содержимое пробирки. Затем пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой с оплавленным концом от­бираем каплю разведенной крови и подносим ее к щели, образующейся между покровным стеклом и счетной камерой. Жид­кость под действием капиллярных сил заполняет пространство над сеткой камеры Горяева.

Подсчитываем число эритроцитов в 5 больших квадратах, разделенных на 16 малых, расположенных в различных местах сетки, например, по диагонали. Считаем клетки, расположенные внутри квадрата и лежащие на любых двух его линиях (например, левой и верхней), чтобы дважды не подсчиты­вать одну и ту же клетку. Находим среднее арифметическое число эритроцитов в одном малом квадрате. Для этого полученное число эритроцитов (Э) делим на 80 (т. к. в 1 большом квадрате находится 16 малых: 5´16 = 80). Объем пространства над одним малым квадратом равен 1/4000 мм³ (мкл). Умножая полученное число на 4000, получаем количество эритроцитов в 1 мм³ (мкл) разведенной крови, умножая на 200 – получаем количество эритроцитов в 1 мм³ (мкл) цельной крови. Итоговая формула для подсчета эритроцитов следующая:

, где

Э – найденная сумма эритроцитов в 5 больших (80 малых) квадратах.

Подсчет лейкоцитов производим в 25 больших квадратах (400 малых). Итоговая формула для подсчета лейкоцитов следующая:

, где

Л – сумма лейкоцитов в 25 больших (400 малых) квадратах.

Для расчета количества лейко­цитов в 1 л крови получен­ную величину умножают на 10⁶.

Результаты подсчета форменных элементов крови заносим в таблицу и сравниваем полученные значения с нормой.

Результаты.

Примечание. Существует набор причин, способных выраженно повлиять на итоговый результат при подсчете количества форменных элементов крови. Это неточность при взятии крови в пипетку, неудовлетворительная градуировка пипеток, образование сгустка крови, неправильное притирание покровного стекла камеры или недостаточная его толщина (ме­нее 0,3 мм), подсчет сразу после заполнения камеры, когда клетки еще не успели осесть на дно, плохо вымытые и недостаточно высушенные пипетки и пробирки, недоброкачественность реактивов, вызывающая гемолиз. Более того, при подсчете лейкоцитов ошибка неиз­бежна в 6–8 % случаев. Это связано с тем, что при большом количестве нормоцитов в пе­риферической крови их засчитывают в число лейкоцитов, т. к. и лейкоциты, и нормоциты – ядро­содержащие клетки. Для правильного определения числа лейкоцитов из об­щего числа ядросодержащих клеток крови надо вы­честь количество нормоцитов.

Вывод (сделайте вывод о количестве эритроцитов и лейкоцитов в крови)

Нормальные величины. У здоровых людей количество эритроцитов составляет 4,0–5,0 ´ 10⁶/мкл (мужчины) и 3,9–4,7 ´ 10⁶/мкл (женщины), лейкоцитов – 4,0–9,0 ´ 10³/мкл.