Работа 3. Определение количества гемоглобина в крови

Кровь человека имеет красный цвет, т. к. в ней содержатся эритроциты – клетки носители гемоглобина, белка, который осуществляет транспорт кислорода от легких к тканям и переносит образовавшийся углекислый газ снова в легкие. Гемоглобин является главным компонентом эритроцитов, составляя 95 % их сухого вещества. Количество его в крови изменяется в зависимости от различных причин, в частности оно уменьшается при некоторых заболеваниях (анемиях).

Определение гемоглобина в крови, гемоглобинометрия, ежедневно проводится в каждом медицинском учреждении. Термин общий гемоглобин распространяется на совокупность ряда форм гемоглобина. В крови здоровых людей обнаруживаются в основном оксигемоглобин и восстановленный гемоглобин, а также в небольших количествах мет- и карбоксигемоглобин.

Строение молекулы гемоглобина. Белок гемоглобин относится к классу хромопротеидов и состоит из бесцветного белка глобина, и окрашенной железосодержащей простетической группы – гема. Молекула глобина содержит 2 a-цепи (141 аминокислота) и 2 b-цепи (146 аминокислот), которые формируют спиралевидную третичную структуру и соединены с кислородпереносящим звеном – гемом. По своему строению гем принадлежит к порфиринам и содержит 4 пирольные группы, объединенные через метиленовые мостики в замкнутое тетрапирроловое кольцо. В центре этого кольца находится атом железа, связанный валентными и координационными связями с 4 атомами азота. Через железо гем соединяется с белковой молекулой. При нарушении этой связи простетическая пигментная группа отщепляется, превращаясь в гематин или при действии кислоты в гемин. Как в восстановленном гемоглобине, так и в оксигемоглобине железо находится в двухвалентном состоянии (Fe⁺²) При окислении железо переходит в трехвалентную, окисную форму (Fe⁺³), неспособную служить переносчиком молекулярного кислорода. При насыщении кислородом каждый атом железа оксигемоглобина связывает по одной молекуле кислорода. На каждую молекулу гемоглобина приходится 4 гема, следовательно, одна молекула гемоглобина связывает 4 молекулы кислорода. Именно гем, придающий гемоглобину характерный алый цвет, является объектом спектрофотометрического анализа, который лежит в основе большинства методов количественного определения гемоглобина.

Существующие методы определения гемоглобина в крови. Для измерения гемоглобина в крови было разработано много методов, основанных на исследовании окрашенного железопорфиринового комплекса – гема: метод Сали, сапониновый метод, пиридин-гемохромогенный метод, гемиглобинцианидный метод Драбкина и другие. Основные погрешности метода Сали, до недавнего времени применяемого в медицинской практике, заключаются в следующем: влияние белков плазмы на реакцию между гемоглобином и соляной кислотой, влияние билирубина, изменение со временем цвета стандартных растворов гематина. Суммарная ошибка метода Сали составляет около 30 %. При использовании сапонинового метода не растворяются тельца Гейнца, гемолизат остается мутным, может изменяться спектр раствора. Пиридин-хромогенный метод дает заниженные результаты. Главным же недостатком всех методов, за исключением метода Драбкина, является отсутствие устойчивых при хранении стандартных растворов.

Международный комитет по стандартизации в гематологии начал работу по унификации гемоглобинометрии в 60-х гг. XX века и на международных симпозиумах, посвященных этому вопросу, в качестве наиболее точного и воспроизводимого был рекомендован спектрофотометрический гемиглобинцианидный метод Драбкина. Он состоит в том, что все формы гемоглобина преобразуются в одну – гемиглобинцианид (синонимы: цианметгемоглобин, цианферригемоглобин), для которого установлен миллимолярный коэффициент экстинкции равный 11,0 при длине волны 540 нм.

Перевод гемоглобина в гемиглобинцианид осуществляется с помощью трансформирующего реагента, содержащего железосинеродистый калий, цианид калия и натрий углекислый кислый. Железосинеродистый калий окисляет все формы гемоглобина в метгемоглобин, который образует с цианидом калия окрашенный в краснокоричневый цвет прозрачный раствор гемиглобинцианида, окраска которого пропорциональна содержанию гемоглобина и очень устойчива при хранении.

Этот метод был выбран ВОЗ по ряду причин. Во-первых, практически все формы гемоглобина преобразуются гемиглобинцианид, т. е. гемиглобинцианид является именно универсальным «общим гемоглобином», для которого определена величина миллимолярной экстинкции, что позволяет проводить количественное фотометрическое определение гемоглобина. Во-вторых, раствор гемиглобинцианида оказался очень устойчивым и стабильным при хранении, сохранял свои свойства неизменными в течение нескольких лет, что позволило точно и достоверно определять гемоглобин. В третьих, сам метод определения гемоглобина по Драбкину чрезвычайно прост в исполнении, доступен для любой диагностической лаборатории и не требует высокой квалификации оператора.

Цель работы. Определить уровень гемоглобина в исследуемой пробе крови разными методами.

Определение гемоглобина (метод Сали). Определение гемоглобина производят колориметрическим способом, основанном на следующем принципе: если исследуемый раствор путем разбавления довести до окраски, одинаковой со стандартным раствором, то концентрация растворенных веществ в обоих растворах будет одинакова, а количества веществ будут относиться как их объемы. Зная количество вещества в стандартном растворе (16,67 г% гемоглобина, т. е. 16,67 г на 100 мл), легко вычислить его содержание в исследуемом.

Материалы и оборудование: гемометр Сали, фильтровальная бумага, 0,1 н раствор HCl, дистиллированная вода.

Гемометр Сали (рис. 6) представляет собой штатив, с вставленными в него тремя пробирками одинакового диаметра. Две крайние запаяны сверху и содержат 1 % раствор солянокислого гематина в глицерина, содержащей 16,67 г% гемоглобина. Средняя градуирована в относительных процентах (деления от 0 до 140), либо грамм-процентах (деления от 0 до 23) и открыта. К аппарату прилагается пипетка для взятия крови на 20 мм³ (метка «20»), обычная пипетка, стеклянная палочка.

Ход работы. В среднюю пробирку наливают 0,1 н раствор HCl до метки «5». Затем с помощью градуированной пипетки берут 20 мм³ (мкл) крови, и обтерев кончик пипетки фильтровальной бумагой, выдувают кровь на дно пробирки так, чтобы верхний слой соляной кислоты оказался неокрашенным. Не вынимая пипетки, споласкивают ее соляной кислотой из верхнего слоя. После этого содержимое пробирки перемешивают, ударяя пальцем по ее концу, и оставляют стоять на 5–10 мин (время необходимое для полного превращения гемоглобина в солянокислый гематин). Затем к раствору по каплям добавляют дистиллированную воду (раствор при этом перемешивают стеклянной палочкой) до тех пор, пока цвет полученного раствора не совпадет с цветом стандарта. Цифра на уровне нижнего мениска покажет содержание гемоглобина в исследуемой крови в грамм-процентах (относительных процентах).

а б

Рис. 6. Гемометр Сали (а) и пипетка для забора крови (б)

Зная величину, выраженную в грамм-процентах можно вычислить относительное содержание гемоглобина в исследуемой крови. [Пример: Равенство красок достигнуто на отметке 15 г% гемоглобина. Следовательно: 15 г% принято за Х, 16,7 г% принято за 100 %. Отсюда Х = (100 % ´ 15 г%)/16,7 г%, где Х – относительное содержание гемоглобина, в %]. В случае градуировки пробирки в относительных процентах необходимо рассчитать количество гемоглобина в грамм-процентах. [Пример: Равенство красок достигнуто на отметке 80. Следовательно исследуемая кровь содержит 80 % количества гемоглобина по сравнению со стандартом (16,7 мг%), принятым за 100 %. Формула для расчета: Х = (16,7 г% ´ 80 %)/100 %, где Х – количество гемоглобина в крови, в г%].

Результаты измерений занесите в таблицу.

Результаты.

Вывод (сделайте вывод о количестве гемоглобина в крови).

Определение гемоглобина (метод Драбкина). Чувствительность данного метода, т. е. возможность выявить минимальное содержание гемоглобина, составляет 2,5 г/л. Принципы спектрофотометрического определения гемоглобина. При прохождении света определенной длины волны через растворы различных веществ часть светового потока поглощается, и по величине этого поглощения, которая зависит только от свойств и концентрации растворенного вещества, определяют концентрацию вещества в растворе. Для этого необходимо определить физическую константу – коэффициент экстинкции растворенного вещества.

Раствор гемиглобинцианида образует отчетливую полосу поглощения света в желто-зеленой области спектра с максимумом при 540–545 нм. Именно этот участок спектра используется для определения концентрации общего гемоглобина. Коэффициент миллимолярной экстинкции гемиглобинцианида равен 11,0. Расчет количества гемоглобина можно провести по следующей формуле:

, где

А₅₄₀ – адсорбция раствора гемиглобинцианида при длине волны 540 нм; 16114,5 – M(r) мономера гемоглобина (64458 Да / 4); 11,0 – коэффициент миллимолярной экстинкции; 1 – длина оптического пути равная 1 см; 10^–3 коэффициент для перевода молярного веса гемоглобина в миллимолярный; Ф – фактор разведения крови (1 : 251, т. е. 20 мкл крови и 5,0 мл трансформирующего раствора

При разведении крови в 251 раз указанная формула преобразуется в:

Для того чтобы свести к минимуму ошибку определения гемоглобина, ВОЗ был предложен калибратор – стандартный аттестованный раствор гемиглобинцианида с установленным содержанием гемиглобинцианида. Как правило, стандартный раствор гемиглобинцианида выпускается в запаянных ампулах светозащитного стекла, т. к. воздействие прямых солнечных лучей способно изменить концентрацию гемиглобинцианида. На практике удобнее пользоваться не одним раствором гемиглобинцианида, а набором из 4 ампул, содержащих различные аттестованные концентрации гемиглобинцианида и перекрывающие весь возможный диапазон нормы и патологии. По 4 ампулам строится калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации гемиглобинцианида. График должен представлять собой прямую линию и выходить из начала координат. Отклонение от линейности свидетельствует о неисправности прибора. Калибровочные растворы выверяются по Международному стандарту и поставляются в 4 ампулах из светозащитного стекла с концентрациями (в пересчете на гемоглобин), равными 50, 100, 150 и 200 г/л. Растворы обладают высокой стабильностью, срок годности не менее 12 месяцев.

Материалы и оборудование: спектрофотометр видимого диапазона (λ = 540 нм) или ФЭК( λ = 520–560 нм), кювета с длиной оптического пути 1 см, стеклянная пипетка на 5 мл, микропипетка на 0,02 мл, мерная колба на 1000 мл, вода дистиллированная, набор реактивов для определения гемоглобина крови гемиглобинцианидным методом, содержащий смесь сухих реагентов (калий железосинеродистый и натрий двууглекислый), ацетонциангидрин, стандартный калибровочный раствор гемиглобинцианина.

Приготовление рабочих растворов реагентов. Для приготовления трансформирующего раствора смесь сухих реагентов, содержащих калий железосинеродистый и натрий двууглекислый, а также ацетонциангидрин количественно переносят в мерную колбу на 1000 мл, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Калибровочный (стандартный раствор) гемоглобина готов к применению.

Примечание. Трансформирующий раствор должен иметь светложелтый цвет и быть совершенно прозрачным. Раствор нельзя замораживать. Он стабилен в течение 3 месяцев при хранении во флаконе из темного стекла при комнатной температуре. Калибровочные растворы хранению не подлежат – открытая ампула используется однократно в неразбавленном виде.

Ход работы. Проба крови (0,02 мл) смешивается с трансформирующим раствором (5 мл), который преобразует гемоглобин крови в гемиглобинцианид. Итоговое разведение составляет 1 : 251. Фотометрирование производят через 30 мин на спектрофотометре или ФЭКе при длине волны 540 нм, перелив раствор из пробирки в кювету с длиной оптического пути 1 см. Измерение производим против трансформирующего раствора. Следует повторить определение не менее 3-х раз и рассчитать среднее арифметическое значение.

По калибровочному графику или по формуле определить содержание гемоглобина в данной пробе крови. Концентрация гемоглобина в пробе крови вычисляется по формуле:

, где

С_HB – концентрация гемоглобина в г/л, Е – оптическая плотность пробы; Е_К – оптическая плотность калибровочного раствора; С_К – концентрация гемиглобинцианида в калибровочном растворе в г/л, 251 – коэффициент разведения пробы крови.

Результаты измерений занесите в таблицу.

Результаты.

Вывод (сделайте вывод о количестве гемоглобина в крови).

Оцените погрешность определения концентрации гемоглобина в крови методом Сали. Для этого принимайте значение показателя, полученное методом Драбкина, за стандарт (100 %). Для перевода г% в г/л следует умножить полученную величину на 10 (16,67 г% соответствует 166,7 г/л).

Нормальные величины. Содержание гемоглобина в крови здоровых взрослых составляет: у мужчин 133–180 г/л (80–108 ед.), у женщин 117–158 г/л (70–95 ед). Содержание гемоглобина у детей изменяется в зависимости от возраста.