Опыт 3. Определение концентрации общих липидов в сыворотке крови.

Для количественного определения общих липидов в сыворотке крови чаще всего пользуются колориметрическим методом с фосфованилиновым реактивом. Общие липиды взаимодействуют после гидролиза серной кислотой с фосфованилиновым реактивом с образованием красного окрашивания. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию общих липидов в сыворотке крови.

1. В три пробирки внесите реактивы по следующей схеме:

2. Содержимое пробирок перемешайте, оставьте в темноте на 40-60 мин. (цвет раствора меняется с желтого на розовый).

3. Снова перемешайте и измерьте оптическую плотность при 500-560 нм (зеленый светофильтр) против слепой пробы в кювете толщиной слоя 5 мм.

4. Рассчитайте количество общих липидов по формуле:

D₂ – экстинкция калибровочного раствора липидов в кювете;

Х - концентрация общих липидов в стандартном растворе.

Дайте определение понятия «общие липиды». Сравните полученное Вами значение с нормальными величинами. О каких биохимических процессах можно судить по данному показателю?

Опыт 4. Определение содержания b- и пре-b-липопротеинов в сыворотке крови.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

3. Стеклянная палочка.

4. ФЭК.

5. Кюветы, 0,5 см.

Реактивы. 1. Сыворотка крови.

2. Хлорид кальция, 0,025М раствор.

3. Гепарин, 1%-ный раствор.

4. Дистиллированная вода.

1. В пробирку налейте 2 мл 0,025 М хлористого кальция и добавьте 0,2 мл сыворотки крови.

2. Перемешайте и измерьте оптическую плотность пробы (D₁) на ФЭК-е при длине волны 630-690 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против дистиллированной воды. Запишите значение оптической плотности D₁.

3. Затем в кювету добавьте 0,04 мл 1%-го раствора гепарина (1000ЕД в 1 мл) и точно через 4 мин вновь измерьте оптическую плотность D₂.

Разница значений (D₂ – D₁) соответствует оптической плотности, обусловленной осадком b-липопротеинов.

Рассчитайте содержание b- и пре-b-липопротеинов по формуле:

Содержание липопротеинов, мг% = (D₂ – D₁) ´ 12,

где 12 - коэффициент, для переводы в г/л.

Укажите место биосинтеза b-липопротеинов. Какую функцию они выполняют в организме человека и животных? Сравните полученное Вами значение с нормальными величинами. В каких случаях наблюдаются отклонения от нормальных величин?

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Занятие № 16. «Обмен липидов (часть 2)»

Цель занятия: изучить процессы катаболизма и анаболизма жирных кислот.

ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:

1. Биохимический механизм окисления жирных кислот.

2. Обмен кетоновых тел: образование, биохимическое назначение. Какие факторы предрасполагают к появлению кетозов у животных?

3. Биохимический механизм синтеза жирных кислот.

4. Биосинтез триацилглицеролов. Биохимическая роль этого процесса.

5. Биосинтез фосфолипидов. Биохимическая роль этого процесса.

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Экспериментальная работа.

Опыт 1. Экспресс метод определения кетоновых тел в моче, молоке, сыворотке крови (проба Лестраде).

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

3. Стеклянная палочка.

4. Фильтровальная бумага.

Реактивы. 1. Порошок реактивов.

2. Моча.

3. Сыворотка крови.

4. Молоко.

1. На фильтровальную бумагу на кончике скальпеля поместите небольшое количество (0,1-0,2 г) порошка реактивов.

2. Несколько капель сыворотки крови перенесите на порошок реактивов.

3. Результаты теста оцените через 5 минут.

Минимальный уровень кетоновых тел в крови, дающий положительную реакцию, равен 10мг/100 мл (10 мг%). Скорость развития окраски и ее интенсивность пропорциональны концентрации кетоновых тел в исследуемой пробе: если фиолетовое окрашивание возникает немедленно - содержание 50-80 мг% и более; если оно появляется через 1 минуту - в пробе содержится 30-50 мг%; развитие слабой окраски через 3 минуты свидетельствует о присутствии 10-30 мг% кетоновых тел.

Следует помнить, что тест более чем в 3 раза чувствительнее при определении ацетоуксусной кислоты, чем ацетона. Из всех кетоновых тел в сыворотке крови человека ацетоуксусная кислота является преобладающей, однако в крови здоровых коров 70-90% кетоновых тел составляет b-оксимасляная кислота, в молоке на ее долю приходится 87-92%.

Сделайте вывод по результатам Вашего исследования. Объясните, чем опасно избыточное образование кетоновых тел в организме человека и животных?